從液氮中取出冷凍細胞後，在37℃水浴中不斷振蕩，促進細胞解凍。轉移到 15 ml 離心管中，加入 10 ml 預熱的 DMEM 完全培養基，輕輕吹氣，2000 rpmX2min 離心，棄上清。
加入 10 毫升 DMEM 培養基清洗，棄上清。加入 10 毫升 DMEM 完全培養基，輕輕吹氣，接種於 10 厘米平皿中，在含 5% CO2 的細胞培養箱中培養。
二、細胞傳代
細胞密度達到 80%~90%。去培養液，10 毫升 PBS 洗 2 次。加入 3 毫升含 0.25% EDTA 的胰蛋白酶，放入細胞培養箱 3 分鐘，再加入 1 毫升 DMEM 完全培養基終止胰蛋白酶消化，轉入 15 毫升離心管。
加入 10ml PBS 清洗細胞培養板，轉入 15ml 離心管，2000rpmX2min，棄上清。再加 10ml PBS（高壓滅菌，40℃保存），吹勻，吸 10 微升計數，按 1×106 個/盤接種，在含 5% CO2 的細胞培養箱中繼續培養。
三、細胞凍存
當細胞密度達到 80% 至 90% 時，除去培養基，用 10 毫升 PBS 沖洗兩次。加入 3 毫升含 0.25% EDTA 的胰蛋白酶，放入細胞培養箱中培養 3 分鐘，加入 1 毫升 DMEM 完全培養基終止胰蛋白酶消化，轉入 15 毫升離心管中。加入 10ml PBS 沖洗細胞培養盤，轉入 15ml 離心管，2000rpmX2min，棄上清。
加入lml冷凍液（90%血清，10%二甲基亞碸），放入冷凍箱（箱內有異丙醇，保證降溫速度），立即放入壹80℃冰箱過夜，第二天放入液氮，至少可保存兩年，不放入液氮可保存三個月。
冷凍液的配制：70% 完全培養基 + 20% FBS + 10% DMSO。DMSO 應緩慢滴加，邊滴邊搖。
註意事項
（1）進入細胞室開始細胞培養時，必須嚴格遵守以下步驟：
①確保細胞操作所用的溶液和耗材都經過滅菌和檢測無問題，沒有把握的不要使用，非特殊情況不要借用他人的溶液。
②確保衣服袖口卷起或白大褂袖口紮緊。
③確保酒精燈中的酒精量正確，必要時補充酒精。
④確保所有需要的溶液和用品都在觸手可及的地方。為了便於單手打開瓶蓋，請在開始實驗前松開所有瓶蓋。
⑤除非瓶口沒有燒焦，否則盡量不要直接倒入溶液。如果倒入失敗，溶液粘在瓶口，可用噴有 75% 酒精的紙巾仔細擦拭瓶口周圍（不要接觸瓶口），然後在火焰上簡單燒灼壹下。
6.如果不能確定操作中使用的耗材是否清潔，必須及時更換。
⑦實驗結束及時清理，保持工作區幹凈整潔，最後用75%酒精擦拭桌面。
（2）防止細胞汙染
①實驗用品防止汙染。細胞培養所用的試劑、耗材、器材等要徹底清洗消毒，各種溶液要認真滅菌，經無菌實驗陰性後方可使用。手術室和其余無菌設備應定期清洗、消毒和滅菌。
② 防止操作過程中的汙染。
③穿易產生靜電或吸附灰塵的衣服進入細胞室前必須換上白大褂。
④實驗開始前戴的手套需確認沒有問題，只要接觸過生物安全櫃外的物品，手套必須及時消毒。
⑤ 進入細胞培養室後關好門，盡量坐下少走動，以免影響生物安全櫃的氣幕。工作開始前，用 75% 的酒精棉球擦拭雙手和瓶蓋。嚴格檢查使用的設備、溶液和細胞，不要將汙染或未經消毒的物品帶入無菌室，更不要隨便使用，以免造成大面積汙染。
⑥細胞操作時要輕拿輕放，必須在無菌區火焰周圍打開瓶口，並把瓶口放在火焰周圍短暫旋轉燒灼，註意不要讓火焰把塑料瓶口燒壞。
⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板應盡量低，盡量減少交談，打噴嚏或咳嗽時絕對不要對著工作區，以免造成不必要的汙染。
8瓶蓋應倒扣放置在遠離自己的地方，以免誤用瓶蓋造成汙染。
9、不要從打開的容器口上經過，以免衣服上掉落的不明物體汙染細胞。
⑩實驗操作過程中註意及時更換巴斯德移液器、移液槍頭和移液管，切忌壹管到底。壹旦發現接觸到不潔凈或不能確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗結束後要及時清理實驗室，保持實驗室幹凈整潔，最後用75%酒精擦拭臺面。
（3）防止細胞交叉汙染
①在進行多種細胞培養操作時，所用儀器要嚴格區分，最好做上標記，便於識別。按照操作順序，壹次只操作壹種細胞，多種細胞、多種操作壹起進行容易發生t坤亂。
②換液或傳液操作時，移液槍尖和粘有細胞的移液管不要接觸試劑瓶口，以免將細胞帶入培養基中汙染其他細胞。
3所有細胞壹旦獲得，或從別處引入，或自行建立，都必須及時保存冷凍，壹旦發生汙染，可將細胞復蘇後繼續培養。
擴展信息：
細胞培養（細胞培養）。p>細胞培養（cell culture）是在體外模擬體內環境（無菌、適宜的溫度、酸堿度和壹定的營養條件等），使其存活、生長、繁殖並保持主要結構和功能的壹種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，生物學的正式術語是細胞培養技術。
無論是對於整個生物工程技術，還是其中的生物克隆技術，細胞培養都是必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以把壹個細胞通過大量培養變成簡單的單細胞或分化很少的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而細胞培養本身就是細胞的克隆。
細胞培養技術是細胞生物學研究方法中壹項重要而常用的技術，通過細胞培養可以獲得大量細胞，還可以用來研究細胞信號傳導、細胞合成代謝、細胞生長和增殖等。
參考文獻：