(1)免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和柱-熒光分光光度法
雖然免疫親和柱檢測法和酶聯免疫吸附法(ELISA)都快速簡便,但ELISA只能檢測單壹毒素(如黃曲黴毒素b1)的含量,而且容易出現假陽性結果,難以控制。而免疫親和柱方法(包括熒光光度法和hplc法)既能達到定量準確的要求,又能達到快速簡便的要求。
使用免疫親和柱可以避免傳統tlc法和hplc法的缺點,同時免疫親和柱與tlc法和hplc法相結合,可以大大提高效率、靈敏度和準確性。
黃曲黴毒素免疫親和柱-熒光光度法是以單克隆免疫親和柱為分離手段,以熒光計和紫外燈為檢測工具的快速分析方法。它克服了 tlc 法和 hplc 法在操作過程中使用劇毒黴菌毒素作為校準標準,在樣品前處理過程中使用多種有毒、有異味的有機溶劑,會毒害操作人員和汙染環境的缺點。同時,黃曲黴毒素免疫親和柱-熒光光度計法檢測速度快,壹個樣品只需10-15min,比傳統方法快幾個小時甚至幾天;儀器輕便易攜帶,自動化程度高,操作簡單,結果可直接讀出,可用於小規模實驗或現場。
黃曲黴毒素免疫親和柱-高效液相色譜法是壹種比傳統高效液相色譜法更安全、更可靠、更靈敏、更準確的方法。它采用單克隆抗體免疫技術,能有效分離黃曲黴毒素或其他黴菌毒素,分離效率高,回收率高。
分析原理樣品中的黃曲黴毒素用壹定比例的甲醇/水提取,過濾、稀釋後用免疫親和柱純化,柱上的黃曲黴毒素用甲醇洗脫,洗脫液中加入溴溶液進行衍生化,以提高測定的靈敏度,然後用熒光分光光度計定量。也可將部分甲醇-黃曲黴毒素洗脫液註入 hplc,分別對黃曲黴毒素 b1、b2、g1、b2 進行定量分析。免疫親和柱是由抗黃曲黴毒素的高劑量單克隆抗體固化在不溶於水的載體上,然後上柱。
(2)酶聯免疫吸附法(ELISA):
1996 年,中根公司建立了辣根過氧化物酶標記抗體的測定技術。由於該方法簡便、靈敏、特異,可用作各種抗原或抗體的測定,20 世紀 70 年代末,該方法被引入黴菌毒素的檢測中,下面介紹壹種競爭性酶聯免疫吸附間接法檢測黃曲黴毒素 b1 的方法。
原理:在固相載體表面吸附已知抗原,洗去吸附末端的抗原,加入壹定量的抗體和待測樣品(含)提取液的混合物,經競爭孵育後,在固相載體表面形成抗原-抗體復合物。洗去多余的抗體成分,然後加入酶標記的抗球蛋白二抗結合物,與吸附在固相載體表面的抗原-抗體結合物結合,再加入酶底物。在酶的催化作用下,底物發生降解反應,產生有色物質,通過酶標儀檢測酶底物的降解量,從而推斷出被測樣品中抗原的含量。
(3)微柱篩選法可用於半定量檢測各種食品中黃曲黴毒素b1、b2、g1、g2的總量。
原理 樣品提取液中的黃曲黴毒素被微柱管風的矽鎂吸附層吸附後,在波長為 365 nm 的紫外光下呈現藍紫色熒光環,其熒光強度與黃曲黴毒素在壹定光密度範圍內成正比。如果矽鎂型吸附層沒有顯示藍紫色熒光,則樣品呈陰性(方法靈敏度為 5-10ug/kg)。由於黃曲黴毒素 b1、b2、g1、g2 不能在微柱上分離,因此結果為黃曲黴毒素的總含量。
(4)黃曲黴毒素檢測的壹步金標法
黃曲黴毒素檢測的壹步金標法是利用單克隆抗體設計的固相免疫分析法。這種壹步式黃曲黴毒素檢測法可在 5-10 分鐘內對樣品中的黃曲黴毒素進行定性檢測。借助黃曲黴毒素標準品,該方法可以估算黃曲黴毒素的含量,非常適合現場檢測和大量樣品的初步篩選。