前 言
SOD的中文名稱是超氧化物歧化酶，其英文名為Superoxide dimutase，分子量(牛血紅細胞) 約 32000 是廣泛存在生物體內的金屬蛋白醇 ， 別名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科學家譽為21世紀最有發展前途的藥用酶。
壹、本工藝是從紅細胞，肝和其它哺乳動物組織分離而得的金屬酶；含兩個亞基，每個亞基各含壹個銅原子和壹個鋅原子，SOD可催化O2，歧化為H2O和O2， 其性質不僅僅取決於酶蛋白，而且還取決於活性部位的金屬離子，按金屬離子類型不同， 可分為Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三種.在壹般條件下，SOD較穩定. 不同來源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光譜略有差異，如牛血SOD在258nm處顯示最大吸收，而豬血SOD的最大吸收峰為265nm，在特定條件下，酶的活性可下降，甚至完全喪失， 如氰化物可抑制SOD活性，雙氧水使SOD活性下降，氯化胍能明顯抑制SOD活性等。
二、SOD用途主要是基於SOD是超氧陰離子清除劑，超氧陰離子(O2~)是人體內有毒物質，它能引起多種疾病，故能清除炎癥過程中伴同產生的超氧離子， 而顯示出強大的抗炎作用。
在醫藥工業：SOD可以治療由於超氧離子引起的各種疾病，如糖尿病，白內障， 風濕性關節炎等，也是消炎的有效藥物，而且還能抗衰老，抗腫瘤，抗輻射， 抗自身免疫疾病，現代研究表明：SOD還能治高血壓，冠心病，膽囊炎，肺氣腫等難治之癥. 日用化學工業：由於SOD有防止細胞老化和解毒等功效， 因此在化妝品和護膚劑等工業產品中，添加SOD之後，具有防曬，祛斑，使皮膚柔嫩的作用.是目前化妝品行業中不可缺少的壹種添加劑，國內及同行都已出現大量產品.食品工業：在食品添加劑加 SOD之後，增強營養，解除毒性，延長體內細胞壽命，國內已有SOD營養液產品， 並通過上海科研單位有關專家的鑒定。
三、SOD的開發前景：目前SOD在全國僅有少數科研單位及生化制藥廠研究和開發本產品，而使用SOD產品廠家卻日益增多，遠不能滿足市場需求 . 為鼓勵和大力開發SOD新產品，國家已將其列入重點科技開發項目，並投放大批經費，現已獲得成功， 開始向企業化生產轉移，市場前景十分廣闊。
四、註意事項：(1)我中心熱忱歡迎社會各界朋友現場學習，由生化工程師向您授課，通過現場操作，指導，培訓，使您盡快掌握該技術。(2)本工藝， 技術資料等不經我公司同意，不得擅自轉讓，翻印，銷售給任何單位和個人，違者法律追究。
新法提煉技術
壹、主要設備：(1)工業用離心機壹臺；(2)恒溫水浴鍋(10L--50L)(可自制)1臺；(3)冰櫃1臺；(4)攪拌機1臺；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml燒杯各3只，50ml燒杯 2 只，50ml，500ml量杯各1個；(6)塑料桶若幹個。
二、主要試劑：(工業純度)檸檬酸鈉，檸檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，去離子水或蒸餾水，葡萄糖凝酸膠SephadexG-- 100 和DEAE--纖維素.
三、試劑的配制：
1.抗凝劑配方：(1)檸檬酸鈉30g，檸檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，壹般此種是每7ml血液，加1ml(抗凝劑).(2)40g/升檸檬酸鈉溶液：在1升水中加入0.9克的氯化鈉。
2.生理鹽水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化鈉。
3.磷酸鹽緩沖溶液的配制：PH7.6，0.2M磷酸鹽緩沖溶液，壹般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，後者加13.0ml混合後即為PH=7.6 緩沖溶液，如果用K2HPO4.3H2O為45.644g/升，NaH2PO4.2H2O為31.21克/升，仍是前者87.0ml，後者13.0ml混合後即得。
4.冷卻劑：在本工藝中有使用-15度低溫，壹般用如下配方：用33克食鹽加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合體可達-21.3度。
四、工藝流程
(壹)除血紅蛋白
1.血液抗凝處理，在新鮮牛、馬、豬血中迅速加入ACD1號抗凝劑，並緩慢攪勻，每7毫升血液中加入抗凝劑1毫升或2號抗凝劑。
2.把抗凝處理的血液放入離心機，以3000r/min離心約15--20分鐘， 用吸管把上清液(黃色血清)小心吸去拋掉，下層的紅血球用2--3倍生理鹽水洗2--3次，在每壹次洗滌中，用離心機以3000r/min離心，7--8分鐘，反復操作後，得到洗滌血紅細胞，洗滌後的血紅細胞在-15度下冷凍可保存半年並不影響產率和比活，在血液量大， 處理不完時必須這樣做。
3.在洗凈的紅血球中加入等體積去離子水，劇烈攪拌30分鐘，使紅血球細胞壁砍碎，以使其內的SOD浸出.最好在0--4度靜止過夜後，把溶血進行有機提取。
4.接著向溶血中緩緩加入0.2--0.25倍體積的預冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍預冷氯仿，攪拌10--15分鐘後，原溶血呈漿糊狀，靜止1--2小時，用濾布除去凝固的血紅蛋白，然後將濾液2500r/min離心約1--5分鐘留上清液拋去沈澱， 此時如果上清液略為微黃色時，可用快速過濾紙過濾，可得到微帶藍色的清澈透明的粗酶液。
(二)粗酶液的初步提純：
1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量預冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沈澱 ， 以3000r/min離心2分鐘收集沈澱，上清液可不必吸取，直接傾倒。
2.熱變性：(除雜蛋白)準備好衡溫浴鍋，在本工藝中，提前30分鐘， 註滿水接通電源後，使之加熱到55--60度以省時間，將沈澱量約50倍量體積比加入0.2MPH=7.6磷酸鈉緩沖溶液，水浴加熱至60度，15分鐘後迅速冷卻到室溫.3000r/min離心2 分鐘得上清液，在上清液中，緩緩滴加0.6倍體積的預冷(-15度)丙酮，生成白色沈澱。
3.初純SOD：在上述沈澱中加去離子水，制成20--30%SOD溶液，分裝入樣品瓶中，放入冷凍幹燥機中，於開機後以0.2--0.1Torr真空度，約1.5--2小時， 得到化妝或食品用SOD，該產品比活大於3000u/mg，外觀呈微帶藍色的白色凍幹品。
(三)SOD進壹步提純：
SOD精品壹般是把SOD產品經過柱層析，柱層析後的SOD沒有小分子等雜質， 層析後為高活性的SOD大分子.SOD精品價格更高，它主要作為生物化學試劑， 化驗室標準試劑試用.目前SOD柱層析有兩種，二者可單獨使用，也可結合使用，壹般是DEAE-- 纖維素層析和SephadcxG--100葡聚糖凝膠層析，將(二)2，熱變性後SOD丙酮沈澱用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4緩沖溶液溶解，有不溶的雜蛋白時.離心拋去沈澱，上清液上DEAE--纖維素或SephadsxG--100層析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脫 ， 洗脫液為PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4緩沖液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度計上用紫外譜325nm處測流出液，合並活力峰，再用蒸餾水反復透析，透析徹底後， 放入樣品皿置於冷凍幹燥機中幹燥後即得SOD精品。
五、註意事項：
1.掌握適當的溫度和時間：雖然SOD對熱較穩定， 但在分離純化過程中最好還是采用較低溫度，壹般以0--10度為宜，時間長不要超過3天。
2.註意提取，提純方法：使用有機溶劑或者加熱均能有效沈澱蛋白質， 但掌握適當溶劑和加熱結合的辦法可以達到最佳效果。
六、SOD的檢測方法：活性檢驗，比較方便的辦法是用連笨三酚自氧化法， 先測得連笨三酚的自氧化速率，然後加入SOD再測得加入SOD之後的氧化速率，按照酶活性單位定義，即在最佳條件下，每分鐘抑制連笨三酚自氧化分解速率達50% 的酶量定義為壹個酶單位.依次求出活力總值 ，同時也可以用聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定其純度，看其分子量32000左右的壹條帶是否與有關文獻指導壹致.
超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 簡稱SOD)是壹種重要的氧自由基清除劑，作為壹種藥用酶，引起國內外生化屆和醫藥屆的極大關註。SOD應用於醫學臨床上可以治療多種疾病，類風濕性關節炎、心肌梗塞等，在防輻射，抗衰老，抗腫瘤等方面也有積極的作用，而且廣泛用於化妝品和食品添加劑的行列。
自1969年Mccord和Fridovich 首次發現從牛血細胞中發現超氧化物岐化以來，到目前為止，國內已有幾十家科研單位對SOD作了大量的研究和試產工作，而且有些已批量生產。SOD引起了國內生化界的重視，1988年在浙江寧波如開了《全國首屆SOD學術會議》。1989年4月在河南開封《第三屆藥用酶學術會議》上，SOD被列為重點開發項目，90年7月在大連《全國第二屆SOD學術會議》，SOD已作為壹種藥用酶發展較快，將成為壹種很有前途的生化產物。
SOD是壹種廣泛存於動物、植物和微生物的生物酶，國外藥用SOD系從血中提取，國內SOD已開發的品種已超過20種，證明我國對SOD的研究和應用已進入新時期。
我國從牛、馬、豬、雞、狗等動物血中提取SOD來源豐富，成本低，提取和純化較方便，藥細胞膜易破，用常規分離純化法可獲得高純度的SOD。
本技術采用熱變性，超濾新技術，不僅大大簡化了工藝過程，而且產品質量和收率都比老工藝有較大的提高，其提取的SOD均為CuZu-SOD。
壹、藥品與儀器：
(1)檸檬酸三鈉：Na3C6H6O7 (2)工業丙酮CaH6O
(3)鄰苯本酚 (4)酸磷鉀K3Poe4
(5)弱堿性陰離子交換劑DEAE Sephadsxa-50外觀40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纖維素。 (6)冷凍幹燥器(自己組配)
(7)層折柱(7.5＊30cm) (8)離心機
以上試劑及其它藥劑、儀器可在各省市化學試劑商店、醫療器械商店購買。
二、Cu、Zu-SOD的提取及純化(牛、馬血為例)
1、工業流程：
加抗凝劑 鹽洗
鮮牛血--------------------->紅血球------------------------>
離心除黃色血漿 加NaCL
熱變性1 熱變性2
壓積紅細胞-------------->淡黃色混合液--------------------->
68度30分鐘 60-65度20分鐘
加丙酮 加丙酮 層析
淺藍色清液----------->絮狀沈澱-------------->沈澱------------>
凍幹
透析除鹽
洗脫----------------->透析液--------->SOD(凍幹品)
2、提取方法
(1)收集紅細胞：鮮牛血100升，加入3. 8％檸檬酸三鈉抗凝劑攪拌均勻，靜置，使紅細胞自然沈降，除去上層大部分血漿，下層液再離心除盡其余血漿，再加入3倍量0.9％氯化鈉(精制食鹽)洗滌兩次， 離心可收集到壓積紅細胞(40升)。
(2)熱變性1：收集的紅細胞再加入4公斤氯化鈉，40克氯化銅，蒸餾水100升攪勻，水浴加熱到68度恒溫30分鐘，迅速冷卻加至室溫，過濾除沈澱，收集濾液。
(3)熱變性2：濾液在65度恒溫水浴下，向濾液中慢慢中入40克氯化銅，至濾液清澈變為淡藍色為止，保溫20分鐘，迅速冷卻至室溫，離心去沈澱得上清液。
(4)SOD粗品：超濾心清液加入0.75倍全積的丙酮沈澱， 離心收集沈澱於離於水，離心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍體積的丙酮沈澱， 離心收集沈澱，沈澱經無水丙酮洗滌脫水兩次，真空幹燥得淡藍色粉末狀SOD粗品
(5)SOD粗品提純：SOD粗品溶於2.5mmol/L，PH值7.6磷酸鉀緩沖液，將該混合液上在7.5＊30cm的層柱上，離子換劑為DEAE-SphadexA-50(該柱事先用緩沖平衡)，以100～200ml/小時速度上樣，完畢後用同壹緩沖A280mm值，低於0.02然後用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸鉀緩沖液進行直線梯度分段洗脫，流速為100ml/小時。用部分收集器收集， 洗脫液經透析除鹽後，得濃縮的透析液，經冷凍幹燥，得SOD成品，(呈淺綠色)。
三、SOD活性測定：
SOD的測定方法很多，常見的有化學法，免疫法等電點聚焦法等，化學法測定的原理主要是利用有些化合物如鄰苯三酚，在自氧化過程中會產生有色中間物降超氧遊離基(O2)這樣就可以利用SOD分例(O2)。阻止中間物的積累而測定其酶活性。
1、試劑及儀器
(1)鄰苯本酚分析純，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度計。
2、測定方法：
(1)鄰苯三酚自氧化速度的測定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4緩沖液中加入10mmol/L的鄰苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯內，在325mm波長下每隔30秒測A值壹次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性測定：
測定方法同測鄰苯三酚自氧化速度，在加入鄰苯三酚前加入待測SOD樣液，測得數據按以下公式計算酶活性。
0.0700－A325mm/min
----------------------------------------＊100％度
0.70
樣液稀釋倍數 樣液稀釋倍數
酶活性(u/m1)＝------------＊反應液總體積＊----------------
50％ 樣液體積
3、蛋白濃度(mg/ml)和蛋白的計算：
SOD或粗酶抽提液，經280mm紫外比色測定後，查牛轎清白蛋的標準曲線，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白濃度＝ug蛋白/ml＊樣液稀釋倍數＊10負3次方＝mg蛋白/ml總蛋白＝mg蛋白/ml＊原液總體積＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的計算：
單位活力(u/ml) 總活力
比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白
蛋白的濃度(mg蛋白/ml) 總蛋白
四、Cu、Zn－SOD性質：
1、Cu、Z n－SOD呈藍綠色，分子量在3200左右，由兩個中壹個Cu和壹個Zn。
2、對熱穩定，天然牛血SOD，75度下加熱數分鐘其酶活喪失很小。
3、PH值對SOD的影響，SOD在PH5.3～10.5範圍內，其催化速度不受影響，PH3.6時SODZn脫落95％，PH12SOD構象發生不可遞的構象，導致酶活性喪失。
4、SOD的紫外線吸收特征：SOD在280mm處沒有吸收高峰。
5、金屬輔其與酶活性。SOD屬金屬酶Zn僅於分子結構有關，而Cu與催化活性有關。
6、SOD是其具有還有和失活作用的。
五、藥品與儀器：
檸檬三鈉，分析純：江蘇花橋北工四廠；
工業丙酮：上海溶劑廠；
鄰苯三酚，分析純：貴州遵義化工廠；
六、SOD的包銷單位：
(1)河南鄭州國營聖科研究所鄭州南陽路14號 郵編：450053《河南科技報》91年10月3日
(2)四川省金堂縣工藝制品技校生化科接待室：金堂準口執行的院內，政府辦公大樓1樓 郵編：610404 聯系人：鄧勇 彭麗 《四川農村報》 91年3月1日
(3)廣東省深圳市上步區石夏東二蒼14號科技所 郵編：518031聯系人：黃秋林 《科技消息報》92年7月10日
說明：1、資料後附的產品銷售地址信息均為我們從近兩年的報刊上摘錄的各單位廣告，並註明有出處。
2、妳先看完資料後，行根據自己的實際情況，先小量試驗， 並事先聯系好產品的收購單位，待取得經驗後再批量生產。
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