[關鍵詞] 新藥；細菌內毒素檢查法；幹擾試驗
[中圖分類號] R927.12 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-7210（2011）11（b）-159-03
How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introduced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test
新藥以細菌內毒素檢查方法代替既往的家兔熱原檢查法是壹個趨勢，在藥害事件的應急處理中有壹定的應用價值，這也符合國際上對動物實驗的“3R”原則（優化、減少、替代）的要求。現行細菌內毒素檢查方法是1968年美國科學家Levin和Bang所建立的鱟試驗法[1]。從開展內毒素檢查的現狀來看，部分單位未能參照《中國藥典》2010年版二部的要求進行實驗和設計，本文著重介紹在建立新藥細菌內毒素檢查法中容易出現問題的細菌內毒素限值的確定及幹擾試驗這兩個環節，力圖為新藥的質量控制以及應急檢驗提供有益的參考依據。
1 新藥細菌內毒素檢查限值的確認
1.1 細菌內毒素檢查限值的計算公式
新藥細菌內毒素檢查限值（L）的確定是整個方法學建立的前提和基礎，現在壹般按照《中國藥典》2010版二部附錄XI E進行確定[2]。計算公式為L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg?h）表示，非放射性註射劑K=5 EU/（kg?h），放射性註射劑K=2.5 EU/（kg?h），鞘內用註射劑K=0.2 EU/（kg?h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，成人體重按60 kg計算，體表面積為1.62 m2。部分抗腫瘤藥物及抗生素的使用劑量以體表面積描述時，可將每平方米體表面積劑量乘以0.027，即可轉換為每千克體重劑量。
1.2 細菌內毒素檢查限值的確認程序
首先根據所研究的新藥品種說明書，通過查閱最新版《臨床用藥須知》等相關權威資料，得到人用每千克體重每小時的最大供試品劑量（M值）並求出L值，將所求得的L值與相關的質量標準（《美國藥典》、《英國藥典》、《日本藥局方》、《歐洲藥典》）以及國家食品藥品監督管理局頒布的轉正標準或註冊標準散件中關於該品種的細菌內毒素限值進行參考對比。
還有壹種方法是參考該品種的熱原檢查劑量（可視為M值），因為熱原劑量的設置壹般為成人臨床用量的1～3倍，與常用的安全系數3～10倍較為接近，這種參考熱原檢查劑量的做法在以前頗為盛行，現在已逐漸少用。
1.3 細菌內毒素限值計算的常見誤區
1.3.1 將成人日均用量誤作最大用量 大多數情況下，說明書或資料往往只提供了某藥的單次或每日用量，實踐中不少人往往將單次用量誤作最大用量進行限值計算，所得限值明顯偏寬。眾所周知，除極少數情況（急性、重癥患者用藥）下的單次用量可作為最大用量外，多數情況的日常用量換算成最大用量，還需考慮壹定的安全系數（壹般取3～10倍）。
1.3.2 誤將每日總用量當成每次最大用量 只根據說明書或資料提供的某藥的每日總用量，未考慮該藥品總量的靜脈滴註時間已經遠不止1 h，這樣求得的限值難於真實反映實際限值，因為M值是反映人用每千克體重每小時能接受的最大供試品劑量，而非全日的總用量。
1.3.3 對於大輸液的細菌內毒素限值確定過於按部就班 沒有考慮大輸液的特殊要求，大輸液的主藥成分只占其中很少的壹部分，實際多為葡萄糖註射液或生理鹽水註射液，如果按主藥成分計算細菌內毒素限值的話，容易偏寬，因而如無特殊情況壹般將熱原檢查劑量10 ml/kg視為最大臨床用量，將大輸液細菌內毒素限值定為0.5 EU/ml。
1.3.4 忽視滴註時帶入的外源性細菌內毒素 某些新藥在臨床使用時是溶於大輸液進行滴註的。假設某抗生素藥品的規格是1 g/支，其使用方法是溶於5%葡萄糖註射液250 ml，在1 h內滴註完畢。可參照下述方法計算該抗生素細菌內毒素限值，此時K=5 EU/（kg?h），因而60 kg的成人每小時體內可以接受細菌內毒素的最大量為300 EU，而在1 h內250 ml的5%葡萄糖註射液最大可帶來125 EU的細菌內毒素，1 g的該藥最多只能帶入175 EU（125～300 EU）的細菌內毒素，因而該抗生素其細菌內毒素限值可定為0.175 EU/mg。如果按常規計算的話，求得限值為0.300 EU/mg。
1.3.5 沒有考慮到主藥外的其他成分 在細菌內毒素限值的確定過程中，特別是原料，要註意扣除主藥外的其他成分（如金屬離子：頭孢噻肟鈉中的鈉，西司他丁鈉中的鈉），因為標準壹般規定為每毫克中頭孢噻肟或西司他丁所含的細菌內毒素量不得過多少EU，而制成的原料往往是含鈉等其他成分的。
2 鱟試劑靈敏度復核試驗
2.1 前期準備工作
試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素並且對試驗無幹擾的器械。耐熱器皿常用幹熱滅菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法（如強酸強堿浸泡法），但需經過確證不幹擾鱟試驗檢查。
2.2 靈敏度復核試驗
當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。需要註意的是，當實測靈敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ為鱟試劑靈敏度的標示值）時，方可用於細菌內毒素檢查，並以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度，日常檢驗中部分檢驗者誤將實測的靈敏度作為批鱟試劑的靈敏度來進行常規檢查或幹擾試驗。
3 鱟試驗檢查的幹擾試驗
3.1 最大有效稀釋倍數（MVD）的確認
MVD是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數，計算公式為MVD=C?L/λ，式中L為供試品的內毒素限值，λ為鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度；C為供試品液的濃度，當L以EU/ml表示時，則C等於1.0；如供試品為註射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。
此處往往根據市售主要的鱟試劑靈敏度範圍（0.03～1.00 EU/ml）來計算幹擾試驗中的有效濃度稀釋範圍。
3.2 幹擾預試驗
取本品1支（原料精密稱取不低於10 mg的量），按照擬定內毒素限值，原料或註射用粉針加內毒素檢查用水溶解並稀釋至不超過MVD規定的系列濃度，註射液直接稀釋至不超過最小有效稀釋濃度的系列濃度，預試驗時壹般可取壹個廠家靈敏度為0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鱟試劑，對供試品原液及其系列稀釋液（供試品陰性對照，NPC）進行幹擾檢驗，另外設立陽性對照（PC）、陰性對照（NC）、供試品陽性對照（PPC），每個濃度平行做兩管，最終得出供試品（批號：20100802）在某濃度及以下濃度對鱟試驗檢查不產生幹擾作用（PPC首次出現“++”的濃度）的結論。供試液的幹擾預試驗結果，見表1。
由表1可以看出，供試品在不高於20 mg/ml的濃度下不幹擾鱟試驗的檢查。
3.3 正式幹擾試驗
按表2制備各系列溶液，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液，參照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，記錄供試液的幹擾情況。
只有當供試品溶液和陰性對照溶液的平行管都為陰性，且鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液的結果在鱟試劑靈敏度範圍內時，試驗方為有效，計算系列鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液和幹擾試劑系列溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。當Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es時，認為供試品在該濃度下無幹擾作用。若供試品溶液在小於MVD的稀釋倍數下對試驗有幹擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進壹步稀釋，再重復幹擾試驗。
當進行新藥的內毒素檢查試驗前或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行幹擾試驗；當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行幹擾試驗。
4 排除供試液幹擾的方法[3]
4.1 樣品稀釋法
選用較高靈敏度的鱟試劑，將供試品進壹步稀釋（低於最大有效稀釋倍數）後進行幹擾試驗，壹般情況下大部分的幹擾作用均能得到有效控制。
4.2 調節pH法
測定供試液的pH值，若不在鱟試劑的有效緩沖pH範圍（6.0～8.0），可選用壹定濃度的HCl或NaOH將pH值調節至6.0～8.0，但要註意應進行方法學驗證（幹擾試驗），確保不幹擾鱟試驗檢查，且對內毒素檢查結果無影響。
4.3 超濾法
通過專用超濾系統，將影響內毒素檢查的藥物小分子雜質濾除，內毒素則留存於濾器內，濾器內加入相應的內毒素檢查用水進行檢查，可在幾乎不影響內毒素濃度的前提下盡量避免小分子藥物的幹擾作用。
4.4 其他方法
微溫保持加熱法；使用去G因子鱟試劑或廠家提供的專用抗增液對樣品進行稀釋（此時須進行幹擾試驗）。
5 常規檢查
使用最大有效稀釋倍數（MVD） 並且已經排除幹擾的供試品溶液來制備溶液供試品溶液和供試品陽性對照溶液，進行細菌內毒素的常規檢測。
6 討論
建立新藥品種的細菌內毒素檢查法，首先要結合臨床最大用量確定其細菌內毒素限值，應用兩個廠家的鱟試劑對3批樣品進行鱟試驗檢查（普通凝膠法或動態濁度法定量試驗），如結果能證實樣品在不低於最大有效稀釋濃度時對細菌內毒素檢查無幹擾作用，且樣品的細菌內毒素常規檢查結果為陰性，此時方可建立該品種的細菌內毒素檢查法[4-7]。
根據臨床最大用量規定及實驗結果，將所研究的新藥細菌內毒素限值定為每毫克主藥（或每毫升）中含內毒素的量應小於若幹EU。經幹擾實驗確證，該新藥在某個濃度或低於該濃度時（但不低於最大有效稀釋濃度MVC）對細菌內毒素檢查無幹擾作用。取本品3批，按擬定的標準檢驗，其內毒素檢查結果均符合規定。