1、稱量。200-300目矽膠，稱取30-70倍量的樣品；如果極難區分，也可以用100倍量的矽膠H.幹矽膠的表觀密度為0.4左右，所以稱取40g矽膠，用燒杯量取100ml也可以。
2.攪拌均勻。用玻璃棒加入兩倍體積的幹矽膠溶劑，攪拌均勻。若洗脫液為石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，則與石油醚混合；若洗脫液為氯仿/乙醇體系，則與氯仿混合。如果不均質，則說明溶劑中水分過多，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水壹起用於分配色譜，則必須事先用無水硫酸鈉將其幹燥。氯仿用無水氯化鈣幹燥，以去除 1%的酒精。如果樣品對酸敏感，則不能用氯仿系統通過色譜柱。
3.裝柱。用棉花塞緊色譜柱底部，無需使用海砂，加入約 1/3 體積的石油醚（氯仿），裝入儲液球，打開色譜柱下的活塞，將均質物壹次倒入儲液球。沈澱時，貯液球內會沾上壹些矽膠，矽膠被石油醚（氯仿）沖入色譜柱。
4.壓實。沈澱完成後，加入更多石油醚，用雙聯球泵或氣泵對柱床加壓，直到流速恒定。柱床被壓縮至約 9/10 體積。無論使用常壓還是加壓色譜柱，都應執行這壹步驟，因為這將大大提高分離效果，並防止色譜柱通過色譜柱時因柱床收縮而產生裂紋。
5.樣品。幹濕法均可。無需海砂。取樣後，加入適量洗脫液，並在矽膠表面塞入壹團棉絮。這樣就可以安全地加入大量洗脫液，而不會洗掉矽膠表面。
6.柱轉運和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間進行權衡。洗脫強度太低不好，建議采用梯度洗脫。收集實例：10 毫克樣品量，1 克矽膠 H，0.5 毫升收集壹個餾分；1-2 克樣品量，50 克矽膠（200-300 目），20-50 毫升收集壹個餾分。
7.檢測。要多使用專用的噴霧顯影劑，如果只用紫外燈，會損失更多的產品，紫外靈敏度壹般比底噴顯影劑低 1-2 個數量級。
8.發送光譜。收集到的產品經過旋幹，通常需要重結晶後才能送去光譜分析。如果樣品太小或液態，可以在發送光譜前通過壹個小的凝膠柱，作為最後的純化手段。這樣可以去除氫譜中 1.5 ppm 左右的所謂 "矽膠 "峰。
矽膠柱色譜分離原理
矽膠柱色譜分離原理是根據物質對矽膠的吸附性不同而得到分離的，壹般來說極性較大的物質容易被矽膠吸附，極性較小的物質不易被矽膠吸附，整個色譜過程即吸附、解吸、再吸附、再解吸的過程。