1. 目的：建立無菌檢查的標準操作規程，確保檢驗結果的準確性。 2. 範圍：適用於本廠質監科化驗室對本廠生產的註射劑進行無菌檢查。3. 責任：化驗員有責任按本操作規程操作，並對檢驗結果負責。4. 定義：無菌檢查法系指檢查藥品是否無菌的壹種方法。5.內容：5. 1無菌操作設備：無菌操作室或超凈工作臺，無菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精燈等。5.1.1無菌室分無菌操作室和緩沖間。在緩沖間內應有洗手盆、幹手器、無菌衣放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應具有空氣除菌過濾的層流裝置，局部潔凈度100級超凈工作臺。緩沖間及操作室內均設置能達到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作臺應保持空氣正壓。5.1.2無菌室應每周和每次操作前用0.1％新潔爾滅或2％甲酚液擦拭操作臺及可能汙染的死角，開動無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時。在每次操作完畢，同樣用2％甲酚或0.1％新潔爾滅溶液擦拭工作臺面，用紫外光燈殺菌半小 時。5.1.3無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理後，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數。取直徑90mm雙碟，在接種室內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開註入溶化的營養瓊脂培養基約20ml，制成平板：在35-37℃預培養48小時，證明無菌後將3個平板以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區域左、中、右各放1個；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘後將蓋蓋好，置35-37℃培養48小時，取出檢查，3個平板上生長的菌落數相加總數不得超過10個。 無菌操作臺面或超凈工作臺應定期請有關部門檢測其潔凈度，應達到100級（壹般用塵埃粒子計數儀），檢測塵埃粒徑≤5μm的粒數不得超過3.5個／升；空氣流量應控制在0.75-1.0m3/s；細菌菌落數平均<1個，可根據無菌狀況定期置換過濾器。5.1.4無菌室內應準備好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、鑷子、75％酒精棉及拖鞋等。5.2儀器、用具：5.2.1真空泵、恒溫培養箱、生物顯微鏡、托盤天平（精度0.1g）、抽濾瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、註射器（要求規格）、試管、雙碟（9cm）、註射針、鑷子、剪刀、白金耳、橡皮管、紗布、棉花（原棉）、不銹鋼吸管筒、接種環、微孔濾膜（直徑約5cm），孔徑應在0.45±0.02μm )載玻片、灑精燈、取樣勺、吸耳球、噴霧瓶。5.2.2用具的包紮：5.2.2.1移液管在移液管上端管內,松松地塞進少許原棉,然後放入不銹鋼滅菌筒內。5.2.2.2試管在管口塞上紗布棉塞。5.2.2.3無菌衣、褲、帽、口罩將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套後裝入布袋，紮緊袋口，再用牛皮紙包好。5.2.2.4註射器洗滌幹凈的註射器及註射針頭裝配好後，放入墊有紗布的帶蓋容器內（飯 第3頁/***7頁盒）壹層層放好，上面蓋上紗布，然後蓋上容器的蓋子，用牛皮紙包好。5.2.2.5濾器 將檢驗合格後微孔濾膜先有水中浸泡濕潤，取出後固定在細菌過濾器的濾板上，濾板下、濾膜上均用耐高溫墊圈墊好，上好濾器。在滅菌前濾器的螺勿擰太緊，濾器上口用8層紗布及牛皮紙包紮，裝妥後放入容器內，再將盛濾器的容器蓋好蓋子，用牛皮紙包紮。5.2.3用具的滅菌：將包紮好的用具，在121±0.5℃蒸汽滅菌櫃中滅菌30分鐘，物品取出時切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內蒸汽冷凝造成負壓，易致染菌，應置溫箱或或加溫烘幹。5.3培養基、試劑：5.3.1壹般采用商品幹燥培養基，臨用時按照使用說明書進行配制，需註意培養基的pH值應符合規定，否則必須校正後，滅菌使用。使用前，按要求分裝滅菌好的細菌培養基須經30-35℃培養48小時，真菌培養基須經20-25℃培養72小時，證明無菌生長後方可使用。 制備的需氣菌、厭氣菌培養基應半個月內用完，在供試品接種前，培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5，否則須經水浴煮沸加熱，只限加熱壹次。5.3.2革蘭氏碘液：先用3-5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入1.0g碘片，攪拌溶解後，加蒸餾水稀釋至300ml，搖勻。置密閉棕色瓶中備用。5.3.3結晶紫染色液：將結紫1.0g溶解於20ml95%乙醇中後，與80ml1%草酸銨溶液相混合，靜置48小時使用。此液穩定，置密閉的棕色瓶中可儲存數月。5.3.4沙黃染色液：將0.2g沙黃溶解於10ml95%乙醇中，待完全溶解後再加蒸餾水至100ml。5.3.5生理鹽水：稱取9g氯化鈉，加水1000ml溶解，分裝後於121±0.5℃濕熱滅菌30分鐘。供作稀釋劑用。 第4頁/***7頁5.3.6 75%乙醇量取無水乙醇75ml,加水稀釋至100ml，搖勻，即得。5.3.7 0.1%新潔爾滅：量取5%新潔爾滅20ml，加水稀釋至約1000ml，搖勻，即得。5.4培養基靈敏度檢查：5.4.1新購的幹燥培養基或采用不同牌號原材料的新鮮培養基，其質量均應符合靈敏度檢查要求。 (1)取藤黃微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的營養瓊脂斜面和白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培養基瓊脂斜面的新鮮培養物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含瓊脂的需氣、厭氣培養基新鮮培養物，用滅菌毛細管將其吸至滅菌離心管內，離心，棄去上清液，沈澱菌體用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻菌懸液。然後以10倍系列稀釋後，制成1ml中含10-100個菌並計數。 (2)取藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣、厭氣培養基新鮮培養物，白色念珠菌的真菌培養基瓊脂斜面的新鮮培養物，取接種至黴菌培養基內，20-25℃用0.9%無菌氯化鈉溶液作10倍稀釋，制成1ml中含10-100個菌並計數。 將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣、厭氣菌培養基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為12ml的需氣、厭氣菌培養基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，接種至每管裝量為9ml的真菌培養基3管，以未接種的培養基作對照，按規定的溫度培養5天並逐日記錄結果。結果判定：以每株菌接種後的培養基不得少於2管呈現生長，即該培養基的靈敏度檢查符合要求。5.4.2配制的培養基應在涼暗處保存，壹般不得超過2周，臨用前細菌和黴菌培養基分別經30-35℃和20-25℃培養不少於48小時和72小時，證明無菌生長後方可使用。5.4.3需氣菌、厭氣菌培養基在試管中裝量高度不得少於7Cm，其指示劑氧化層不得超過培養基深度的1／5，否則須經水浴煮沸10分鐘，但只限加熱壹次。 第5頁/***7頁無菌試驗培養時間結束時，指示劑氧化層應不超過培養基深度的1／2。5.5對照用菌液的制備：5.5.1試驗用菌種、菌種的復蘇、菌種的接種與保存等均應按照“抗生素微生物檢定法”標準操作規程項下操作。5.5.2金黃色葡萄球菌菌液用接種環取金黃色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物少許，接種至營養肉湯培養基內，在30-35℃培養16-18小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:1065.5.3生孢梭菌菌液用接種環取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳，接種至相同培養基內，在30-35℃培養18-24小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106。5.5.4白色念珠菌菌液用接種環取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳，接種至真菌培養基內，在20-25℃培養24小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:105。5.5.5上述制備的菌液，壹般當日使用。5.6進入無菌室的操作要點：5.6.1根據試驗程序,將用具物品搬入緩沖間,打開紫外光燈和空氣過濾裝置並使其工作1小時以上。5.6.2操作人員用肥皂水刷洗雙手,關閉緩沖間紫外光燈,進入緩沖間內,關閉第壹層門,用2%來蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液洗雙手,用消毒毛巾擦幹,換上無菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3關閉無菌室內紫外光燈，進入第二層門並將用具搬至無菌室內，關閉無菌室門。5.6.4凡進入無菌室後不應再外出取物品，因此，在每次試驗中所用物品必須計劃好，並準備好備用物品。從進入第壹層門直至無菌室內，隨操作人員的進入應噴霧2%來蘇爾或0.1 %新潔爾滅溶液。5.7檢查法：5.7.1無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用於非抗菌作用的供試品；後者適用於有抗菌作用的或大容量的供試品。5.7.2操作時，應先用0.1%新潔爾滅浸泡或擦拭容器表面後，以無菌的方法取 第6頁/***7頁內容物。5.7.3凡無菌檢查中，均應取相應溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對照。5.7.4供試品制備： 用滅菌鑷取出註射器，在火焰旁將針芯插入針管並安上針頭，蓋為橡皮塞時，用註射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取藥液。按規定須稀釋或滅活的供試品，可直接或將瓶內供試液抽出至滅菌玻璃容器內進行滅活處理並稀釋至規定的體積和濃度；抽取瓶中內容液體時，應將供試品倒置並使針頭在液面下。5.7.5直接接種法：按規定量取供試品，以無菌操作將該供試品分別接種於需氣菌、厭氣菌培養基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌液1ml，作陽性對照，另接種於真菌培養基5管。輕輕搖動，使供試品與培養基混合。需氣菌、厭氣菌培養基管置30-35℃、真菌培養基管置20-25℃培養7日。在培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。陽性對照管在24小時內應有菌生長，如在加入供試品後，培養基出現渾濁，培養7天後，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中或斜面培養基上繼續培養，細菌培養2日，真菌培養3日，觀察是否再出現渾濁或斜面有無菌生長，或用接種環取培養液塗片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。5.7.6薄膜過濾法： 將微孔濾膜過濾裝置、抽濾瓶、排氣管與真空泵相連，真空泵可置無菌室外。取規定量供試品，按規定的方法處理後，加入0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，混合後，通過裝有孔徑不大於0.45μm 的薄膜過濾器，減壓抽幹後，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次，每次至少100ml，取出濾膜分成3等份，分別加入上述二種培養基中，按規定溫度和時間培養。陽性對照管應根據供試品特性加入相應對照菌液1ml（抗細菌藥物，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗厭氧菌藥物，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌藥物，以白色念珠菌為對照菌）。陽性對照管細菌應在培養24-48小時，真菌應在培養24-72小時有菌生長。5.8結果判斷： 第7頁/***7頁當陽性對照管顯渾濁並確有菌生長，陰性對照管呈陰性時，可根據觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管均為澄清或雖渾濁但經證明並非有菌生長，均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管中任何1管顯渾濁並確證有菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。6 培訓6.1 培訓對象：化驗員。6.2 培訓時間：二小時。7 記錄 記錄名稱 保存部門 保存時間 無菌檢驗記錄 質監科 藥品有效期後壹年 QF-01-007-00無 菌 檢 驗 記 錄品 名： 批 號： 規 格： 檢驗日期： 年 月 日培養基名稱需氣、厭氣菌培養基真菌培養基培養培養溫度30—35℃20—25℃培養時間管 號1234512345培養天數及結果1234567結 論備 註 復核人： 檢驗人：
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