檢查細菌培養，將明顯渾濁的菌液倒入編號的2ml離心管中進行細菌沈澱，以12000rpm左右的轉速離心65438+/min，確保無懸浮物後取出；將離心管倒置在衛生紙上，用力敲擊，直至液體培養基完全去除；如果發現沈澱的細菌較少，可再加入2ml細菌溶液再次沈澱細菌。
加250？用振蕩器振蕩加入RNA酶1的l緩沖液S1，直到沈澱完全懸浮。
什麽是1。緩沖區S1？主要成分是什麽？
50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0。
2.緩沖區s1的作用是什麽？
50 mM葡萄糖:加入葡萄糖後最大的好處是懸浮的大腸桿菌不會很快沈積在管底。因此，如果緩沖液S1中缺少葡萄糖，它對質粒提取本身幾乎沒有影響。
EDTA:眾所周知，EDTA是Ca2+、Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，在分子生物試劑中的主要作用是抑制DNA酶的活性和微生物的生長。在緩沖液s 1中加入高達10 mM的EDTA，無非是螯合大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子。如果不加EDTA，只要在短時間內完成質粒提取，就不用擔心DNA會很快降解，因為TE緩沖液中有EDTA最終會溶解質粒。但是為了測序，我們用水溶解質粒，所以EDTA是必須的。
3.如果提取的質粒正好用完了，可以用水代替嗎？
只需使用等體積的水或LB培養基懸浮細菌。有壹點不能忘記，就是細菌必須懸浮均勻，不能結塊。
質粒提取過程的詳細說明-熱解
加250？l緩沖S2，緩慢倒置7-8次，直至混合液澄清(此步驟操作時間不得超過4分鐘)；
☆註意:倒車時不要太暴力，否則會有細胞核DNA汙染；如果由於低溫在緩沖S2中有SDS沈澱，可將其放入55~60C的水溶性鍋中，適當加熱至澄清後再使用。
1.質粒提取的原理是什麽？
堿裂解法
2.BufferS2是什麽？主要成分是什麽？
0.2 N氫氧化鈉/ 1%十二烷基硫酸鈉
SDS:十二烷基硫酸鈉(SDS)是洗滌劑的主要成分。在提取DNA的過程中，經常使用它來使蛋白質變性並將其與DNA分離。
3.BufferS2的作用是什麽？
NaOH:NaOH是溶解細胞的最佳試劑。無論是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，遇到堿幾乎都會瞬間溶解。用不新鮮的NaOH，即使用SDS，也不能有效溶解大腸桿菌，因此自然難以高效提取質粒。如果只用SDS，當然可以提取少量質粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了壹點。
4.為什麽妳不能加入緩沖S2太長時間，並輕輕地移動？
第壹，時間不能太長，千萬不要在這個時候接電話，因為在這樣的堿性條件下，基因組DNA片段會慢慢斷裂；第二，壹定要輕輕攪拌，否則基因組DNA也會斷裂。
質粒提取過程的詳細說明-中和
加入400ul緩沖S3，劇烈倒置5~10次，使其充分中和。同時將大塊白色沈澱搖勻成小塊進行離心。
以13600 rpm左右的轉速離心沈澱12分鐘。如果有沈澱不完全引起的白色絮狀物質，反復搖勻離心，直至沈澱完全。
什麽是1。緩沖S3？主要成分是什麽？
3 M乙酸鉀/2 M乙酸
2.加入緩沖劑S3後，白色沈澱是什麽？& amp3.BufferS3的作用是什麽？
大家都知道加入溶液三後會有大量的沈澱，但大多數人並不了解這種沈澱的本質。
最常見的誤解是SDS遇到酸性時產生的沈澱。如果妳這麽懷疑，把2M醋酸溶液加到1% SDS溶液中，看看是不是這樣。大量沈澱的出現顯然與SDS的加入有關。如果方案二不加SDS會怎麽樣？會有少量沈澱，但量少很多，明顯是鹽析和酸變性沈澱的蛋白質。既然SDS不是酸沈澱的，那鹽沈澱可以嗎？在1% SDS溶液中慢慢加入5 N NaCl，妳會發現SDS在高鹽濃度下會沈澱。因此，高濃度的鹽導致SDS的沈澱。但是如果妳加入KCl而不是氯化鈉，妳會發現沈澱的量要多得多。實際上，十二烷基硫酸鈉遇到鉀離子就變成了十二烷基硫酸氫鉀，PDS)，PDS不溶於水，所以出現沈澱。從這個角度來看，加入溶液III後的沈澱實際上是SDS中鉀離子取代鈉離子形成不溶性的PDS，高濃度的鹽使沈澱更加完全。眾所周知，SDS特別喜歡和蛋白質結合。平均來說，兩個氨基酸與壹個SDS分子結合。鉀鈉離子置換產生的大量沈澱自然沈澱了大部分蛋白質，同時大腸桿菌的基因組DNA也被* * * *沈澱。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長，長的DNA自然很容易被PDS沈澱，雖然SDS不與DNA分子結合。
2 M醋酸的作用是什麽？
就是中和NaOH，因為長期堿性條件會打斷DNA，所以要中和。基因組DNA壹旦斷裂，只要是50-100 KB的片段，就沒有辦法被PDS***。所以堿處理時間要短，不能劇烈搖動，否則最終得到的質粒中總會有大量的基因組DNA混在壹起，瓊脂糖電泳可以觀察到壹條粗的總DNA帶。
質粒提取過程的詳細說明-純化
tr/min用移液管將上壹步的上清液轉移到吸附柱中，以約10500 rpm的速度離心1分鐘。
註意:不要將沈澱物轉移到吸附柱中。1樣本使用1槍頭。
為什麽離心上清液離心後質粒DNA會吸附在膜上？
高鹽狀態下，矽膠膜吸附DNA具體來說；然而，在低鹽或水溶液的狀態下，DNA被洗脫。
質粒提取過程的詳細說明-洗滌脫鹽
取出DNA吸附柱，丟棄廢液收集管中的液體，將柱放回該離心管中，向柱中加入500ul洗滌液，高速離心(10，000rpm)30秒。
重復上述步驟壹次。
取出DNA吸附柱，丟棄廢液收集管中的液體，將柱放回該離心管中，並以最大速度離心2分鐘。
洗滌液需要洗滌兩次，目的是為了更充分的去除殘留的蛋白質、鹽離子等雜質，保證吸附在矽膠膜上的DNA盡可能的純凈。
質粒提取過程的詳細說明-產物回收
將DNA吸附柱移入新的1.5ml離心管中，在DNA吸附柱的膜中心加入30-40ul預熱的無菌雙蒸水，室溫靜置2分鐘，然後以12000 rpm離心1分鐘，離心管底部為質粒DNA。