利用高溫殺死微生物（超過最高生長溫度）的方法。加熱殺菌的原理：當高溫作用於微生物時，首先引起細胞內生理生化反應速率加快，體內對溫度敏感的物質如蛋白質、核酸等，隨著溫度的升高而遭受不可逆的破壞，從而導致細胞內原生質結構發生變化，酶的破壞，使細胞失去協調生命的功能，停止生長發育。隨著高溫的持續作用，細胞內原生質會凝固，酶的結構被完全破壞，活性消失，生化反應停止，滲透交換等代謝活動消失，細胞死亡。加熱滅菌可分為幹熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。
①幹熱滅菌 利用燃燒或幹熱空氣滅菌而無飽和水蒸氣參與的滅菌方法稱為幹熱滅菌法。由於幹熱滅菌使用方便，方法簡單，所以在生產中應用廣泛。如火焰滅菌法：直接用火焰將微生物燒死，故又稱焚燒滅菌法。用這種方法滅菌既徹底又迅速，但只適用於金屬接種工具、試管口和汙染物品。熱風滅菌法：即在電熱恒溫幹燥箱內用幹燥的熱風進行滅菌。
2）濕熱滅菌即利用蒸汽滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌四種。
①高壓蒸汽滅菌 由於高壓蒸汽穿透力強，溫度比常壓高，可大大縮短滅菌時間，提高效率，加之蛋白質在濕熱條件下易變性，在熱蒸汽條件下，細菌芽孢在120℃時，經20～30分鐘即可全部殺死。如果被滅菌材料較大且不易穿透，壓力可提高到 0.152 兆帕，延長至 1～2 小時。高壓滅菌時，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖 2-6）。
圖 2-6 高壓滅菌鍋
使用高壓滅菌鍋時，必須完全排除鍋內的空氣，並用飽和蒸汽取而代之。如果不排除空氣，高壓滅菌鍋內的溫度會低於相同壓力下純飽和蒸汽產生的溫度，從而影響滅菌效果。
這種方法適用於各種耐熱物品的滅菌，如壹般培養基、生理鹽水及其他溶液、玻璃器皿、工作服等。使用的蒸汽壓力和時間應根據被滅菌物品的性質、體積和容器類型來決定。
②常壓蒸汽滅菌 這是自然壓力、100℃蒸汽滅菌法。它設備簡單，成本低廉，目前使用最為廣泛。只需建壹個爐子，買1～2口鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，容積大小可自行決定，但不宜過大，以能裝800～1500個瓶子為好。設計常壓竈應註意的問題：尺寸根據生產規模確定，竈頂最好做成圓弧形，這樣冷凝水可沿竈內壁下流而不會打濕棉塞；竈倉應采用層架結構，以便分層放入消毒材料；竈上應安裝溫度計，可以隨時觀察竈內溫度變化；由於滅菌時間較長，鍋內水分蒸發不夠，竈上應安裝加水裝置，向竈內加大容量的水；竈倉的封閉程度應盡可能高，這樣既能提高滅菌效果，又能節省燃料。菇農在生產中還常用小型蒸汽發生裝置，引入蒸汽後直接用木條將下邊的壕溝圍起來，四周用多層塑料布密封袋堆進行常壓滅菌。這種方法不需要生爐子，簡單省力（圖 2-7）。常壓滅菌壹般燒開水保持8～10小時，悶壹夜即可。
圖 2-7 簡易常壓滅菌法
3 常壓間歇蒸汽滅菌法 這是用常壓蒸汽反復多次滅菌的方法。具體做法是將待殺菌的物品放入盆中，100℃處理1小時左右，殺死營養細胞中的微生物，讓其冷卻到30℃左右，此時芽就會萌發，再用同樣的方法進行熱處理，反復三次，即可達到殺菌的目的。這種方法可用於不耐高溫的藥物、營養液和特殊培養基的滅菌。
4.低溫巴氏殺菌法即在60～70℃下，經過壹定時間，殺滅有害微生物的方法。適應於不耐高溫物品的滅菌。有些培養基，在高溫下被破壞，用這種方法既可殺滅致病微生物的營養物質，又可使培養基的成分不會受到嚴重破壞。食用菌生產中培養料的堆積發酵過程，就是利用這壹原理殺死其中的害蟲和雜菌。
（2）過濾滅菌法
又分為液體過濾和空氣過濾兩種，即利用機械方法，設計壹種孔徑比細菌篩孔小的篩網，制成各種過濾網，通過機械過濾，只讓液體培養基或空氣從篩孔中流出，各種微生物菌體留在篩網上，從而達到滅菌的目的。這種方法適用於熱不穩定的小體積液體培養基（如動物血清、蛋白質、酶、維生素等）和氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理是通過對攜帶病菌的空氣進行過濾和滅菌，形成無菌空氣，並從風洞吹出，使工作臺範圍內處於無菌狀態。過濾滅菌的最大優點是不會破壞培養基中各種物質的化學成分。常用的過濾器有矽藻土、石棉、陶土制成的，也有火棉膠、硝酸纖維素制成的濾膜。
（3）輻射滅菌法
利用輻射產生的能量進行滅菌的方法稱為輻射滅菌法。輻射可分為電離輻射和非電離輻射，α射線、β射線、γ射線、X射線、中子和質子、微波等為電離輻射，紫外線、臭氧、陽光等為非電離輻射。
1）紫外線滅菌 紫外線滅菌的原理是利用紫外線輻射。用燈管直接照射細菌引起光化學反應，誘導細菌細胞質中的胸腺嘧啶形成二聚體，從而抑制DNA的復制而發生變性、致死。另壹方面，空氣在紫外線照射下產生的臭氧（O3）也具有壹定的殺菌作用。紫外線的有效作用距離為 1.2 至 2.0 米。紫外線燈壹般懸掛在接種室或培養室的上方，數量視房間大小而定，接種室為 1 至 2 人操作，安裝壹盞 30 瓦的紫外線燈即可。每次接種前，應將所需設備放入接種室（箱），然後打開紫外線燈照射。如果接種室較大，開燈照射 2 小時即可達到滅菌效果；如果較小，只需開燈照射半小時左右即可達到滅菌效果。由於紫外線的穿透力較弱，連普通玻璃都無法過濾，因此只適用於空氣或物體表面的殺菌。紫外線對人體皮膚特別是眼睛有殺傷作用，應避免直視，工作時應關閉紫外線燈。紫外線消毒時，如果工作場所處於稍暗無光的情況下，可以提高殺菌效果。細菌在接受致死量的紫外線照射後，再給予可見光照射，有些細菌還有復活的可能。幹細胞對紫外線的抵抗力比濕細胞強，芽孢對紫外線的抵抗力比滋養細胞強。
2）微波殺菌 由於微生物細胞中含有70%～90%的水分，水分子在微波電場中被極化，並隨著電場方向的改變而旋轉，在旋轉過程中分子間高速摩擦產生熱能，它不同於外界加熱，可以在短時間內使細胞爆裂而物體本身的溫度僅有極微量的升高，以達到殺菌效果。可以達到殺菌的效果。用 YM7601 微波爐殺滅食物中的 192 萬個大腸桿菌只需 60 秒。
3）臭氧發生器消毒 臭氧（O3）具有強氧化作用，能破壞微生物的細胞膜和核酸。O3 還是壹種瞬時物質，常溫下可自然分解，還原成氧氣。殺菌的原理其實與紫外線消毒的原理非常相似。