作者：佚名 文章來源：互聯網 點擊數：132 更新時間：2009-8-10
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臨床實驗室分子診斷的標準化
李金明 衛生部臨床檢驗中心 100730
[摘要] 臨床實驗室分子診斷涉及病原體核酸、人類基因和各種蛋白等大分子的測定，在許多臨床疾病的診斷方面，有極為關鍵的作用。工作程序、試劑方法的標準化以及標準物質的應用，是保證實驗室檢驗結果準確性的前提。在日常檢驗工作中應用標準物質，將極大地改善不同實驗室間檢驗結果的可比性，從而逐步實現不同實驗室間檢驗結果有條件的互認。
[關鍵詞] 分子診斷；標準化；標準物質
臨床實驗室分子診斷現已成為臨床檢驗各學科分支中最具發展潛力的領域，其涉及病原體核酸、人類基因和各種蛋白等大分子的測定，是臨床疾病診斷中不可或缺的手段。但在臨床應用中，目前仍存在同壹實驗室不同檢測批次間或不同實驗室對同壹標本檢測間結果的差異，這已成為時常困擾臨床醫師、患者以及實驗室技術人員的普遍性問題。此外，這也是當前不同實驗室間結果有條件互認的壹個巨大障礙。而造成不同臨床實驗室間檢驗結果差異的原因，通常包括臨床標本的采集、試劑方法、測定操作、儀器設備的維護校準、數據處理及結果報告、標準物質及質控物的應用等方面的不規範等因素。然而，儀器設備、試劑生產廠家和臨床實驗室本身在臨床實驗室分子診斷標準化中起著非常關鍵的作用。通常，臨床實驗室分子診斷標準化應主要包括以下幾個方面。
壹、 臨床標本采集、運送和保存的標準化
臨床標本的采集、運送和保存對檢驗結果往往有決定性的影響，而這些問題常涉及臨床實驗室與其他相關科室的工作分工與協作，此點以前不太被關註或認為是難以控制的問題。但為保證得到正確的檢驗結果，必須制定壹個規範的臨床標本采集、運送和保存的程序。
常用的臨床標本通常有血清（漿）、全血、分泌物、組織、尿液、腦脊液及其他體液等，對這些標本的采集、運送和保存的標準化主要是對標本采集的具體方法、所用容器、采集量、采集時所用材料和用具、運送方式和不同時間中標本保存條件等做出明確而又詳盡的規定，寫成標準操作程序（standard operation procedures, SOP）；並對參與該程序運行的相關人員進行必要的培訓，及時與臨床科室進行全面而有效的“對話”（包括工作溝通、定期質量評價、糾錯措施），是保證所制定的程序得到確實執行的必不可少的環節。
二、 臨床標本制備處理和核酸提取方法的標準化
臨床標本的處理對於分子診斷技術，尤其是核酸和基因檢測是極為關鍵的壹個環節。在抗原和抗體的免疫學測定中，臨床標本中存在的幹擾物質，如類風濕因子（RF）、補體及其他非特異因子等有可能會造成定性測定的假陽性或假陰性結果或使定量測定結果偏高或偏低。在檢測前，對標本進行適當的稀釋、加熱或其他適當的預處理則可去掉這種幹擾作用。
在核酸和基因檢測中，臨床標本中存在的血紅蛋白、免疫球蛋白G（IgG）、乳鐵蛋白、核酸酶、尿素、膽鹽、黏蛋白和多糖等，都能在聚合酶鏈反應（PCR）擴增過程起抑制作用，而影響特定靶核酸的檢測。采用簡便而又高效的核酸純化方法，去掉臨床標本中的上述PCR抑制物，是保證得到正確的檢測結果的前提。有些臨床標本如痰[ 6,7]，在核酸提取前，對標本進行適當、有效的預處理，對保證後續核酸提取以及擴增檢測的成功非常關鍵。此外，在臨床分子診斷中，必須建立壹個標準化的臨床標本制備處理程序，這對於核酸提取、提取的效率及能否有效地去掉PCR抑制物，也是核酸純化方法標準化的重要指標。
三、檢測試劑和方法的標準化
組成壹個可用於臨床分子診斷的試劑和方法模式，可有多種選擇，如PCR因其極高的檢測靈敏度，很容易因以前擴增產物或標本間交叉汙染，而出現假陽性結果。此外，標本中PCR抑制物的存在、擴增儀孔間溫度的差異、試劑的濃度不合適以及標本中核酸提取的失敗等，則容易造成假陰性結果[1,8]。因此，試劑生產廠家在研發相應的臨床分子診斷試劑時，必須仔細考慮上述因素，采用最理想的檢測方法。如PCR試劑則應從如何有效避免假陽性和假陰性結果的角度出發，在試劑盒中以dUTP替代4種dNTP中的dTTP，再加上尿苷糖基酶（UNG），使擴增產物DNA中出現天然DNA中所沒有的U，在新的檢測擴增中，如有以前擴增產物的汙染，則其可在UNG的作用下被降解。這樣可壹定程度地避免以前擴增產物汙染所致的假陽性。又如在試劑中加入競爭性或非競爭性內標，則可有效監測核酸提取、擴增及產物分析中出現的誤差，從而避免假陰性結果。
四、檢測結果分析的標準化[9-11]
臨床實驗室分子診斷方法依其對測定結果的表達方式，可分為定性和定量兩大類。定性測定常以“有”或“無”，也即“陽性”或“陰性”來表達測定結果。定量測定的結果則以濃度（如IU/L、IU/ml、μg/L、拷貝數/ml等）的方式表達。定性測定結果確定的依據在於陽性判定值（cut-off）的建立，cut -off 值的確立應盡可能地避免假陽性或假陰性結果的出現。定量測定的依據為使用系列濃度標準品測得的劑量反應曲線（即標準曲線）或是內標的量。
定性測定中設定cut-off 值是為了盡可能地避免假陽性或假陰性結果，但處於cut-off 值壹定範圍的測定結果具有某種不確定性，通常稱為“灰區”。在臨床實際檢測中，“灰區”範圍大小的確定以及處於“灰區”範圍內的臨床標本的結果如何報告，常使實驗室技術人員感到困惑。因此，對其進行標準化的程序規定，不但可使實驗室技術人員在報告結果時有規則可循，而且可有效減少或避免錯誤結果的發出。
定量測定的數據處理，常采用不同的數學模式，這不僅可用來改善標準曲線繪制的精密度，從而以較少的數據和計算獲得較為準確的結果，又能省時、省錢。如今微型計算機已在臨床實驗室中迅速普及，各種測定數據處理軟件層出不窮，使得定量測定結果的表達更為準確和有效。例如：實時熒光定量PCR對閾值的設定，標準曲線中斜率、截距和相關系數的允許變化範圍在其數據處理和結果報告的標準操作程序中做出明確規定。在以縱坐標為Ct值（特定靶核酸擴增曲線與閾值線相交時的擴增循環數），橫坐標為起始拷貝數的實時熒光定量PCR（目前絕大部分為此類）時，斜率A = - ，其中E為擴增效率；截距B = log YCt，其中YCt為達到特定靶核酸擴增曲線與閾值線相交時的擴增循環數時的擴增產物的量。因此，斜率A與特定實時熒光PCR的擴增效率有關，當擴增效率為100%，即1時，A為-3.32，可見壹個特定實時熒光定量PCR方法，其斜率應≤-3.32，越大說明效率越高。截距B則為原始模板趨向於0時，亦陰性標本檢測的Ct 值，因此，壹個實時熒光PCR，如果設定的擴增循環數為40，則其截距B即應≥40。
理想情況下，測定數據處理報告應達到下述要求：（1）通俗易懂。要讓所報告的結果，即使是不熟悉該試驗的人，也能理解。（2）定性測定結果明確。即反應或不反應、陽性或陰性、在正常範圍內或不正常等。（3）定量測定須有壹定的線性範圍。（4）處理後得到的數據要具有可重復性。（5）試驗的評價不應建立在假定的正態分布上。（6）應有適當、合理的解釋。
五、標準物質和質控物的應用[2,12-26]
標準物質是臨床分子診斷標準化的核心，也就是說，臨床檢測的某壹標本中特定標誌物的量值，不管其用什麽方法測定，均可以通過統壹的標準物質，而得到相近的結果，其量值均可溯源至同壹標準，從而具有可比性。
標準物質可歸類為第壹、第二和第三3個等級。壹級標準物質數量有限，可使用10至20年，其為凍幹品。壹級標準可用來校準第二和第三級標準。例如，常規測定中使用的校準物質。國際標準可作為第壹級標準物質，壹旦第壹級標準確定，二級標準可用來維持校準。校準的二級標準可在以國家為基礎的範圍內供應。目前可得到的國際標準物質中特定分析物的濃度壹般以IU/L表示，也可用mol/L和g/L來表示，後者通常是分子結構清楚的物質。
在臨床測定中所使用的校準品的值,溯源至壹級標準的值,通常由下述幾個校準步驟組成，即標準品和測定方法、緩沖液及其基質、稀釋的控制、最終結果的統計學評價和質量控制等。當建立壹個測定方法時，通過上述過程可將壹級標準物質的值傳遞至二級、三級標準品和（或）校準品，使得所建立方法的測定值可溯源至壹級標準物質。當引入壹批新的試劑時，即需要重復這種傳遞過程，從而保持校準的可靠性。
標準物質定值的測定方法可使用決定性方法、參考方法和確定程序的多中心測定。決定性方法（definitive method）是壹個具有高精密度及沒有系統偏差的參考方法。當沒有決定性方法可使用時，則可確定壹個參考方法。參考方法的變異要大於決定性方法。在蛋白質、核酸和基因檢測中，目前很少有參考方法，國際上對標準品的定值通常是遵循壹定的程序，采用多個參考實驗室聯合定值的模式，結果均以IU/L表示，通常是根據壹定的統計學方法，以大部分實驗室能檢出的最低含量定為1 IU/L。
質控品則是含量已知的處於與實際標本相同的基質中的特性明確的物質。這種物質通常與其他雜質混在壹起，根據其用途可分為室內質控品、室間質評樣本和質控血清盤等3類。室內質控品用於臨床實驗室日常工作的室內質控，其定值應可溯源至二級標準品。室間質評樣本則由主持室間質評的機構制備或監制，通常無需準確的定值，但對於定性測定，則需用各種已有的方法，以明確其陰陽性。質控血清盤為經過篩檢得到的有明確陰陽性的原血清標本，陽性強弱不壹，陰性標本則可能含有對測定會產生非特異幹擾的物質，陰陽性血清總數之比通常為1:1，血清盤可用於特定的定性免疫測定試劑盒的質量評價，評價內容包括特異性、敏感性、符合率和對可能存在的非特異幹擾物的拮抗能力。
目前國際上，可用於臨床分子診斷的國際壹級標準物質已有很多，如血清蛋白、免疫球蛋白、細胞因子、激素、壹些腫瘤標誌物〔甲胎蛋白（AFP）、前列腺特異抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）等〕、病毒核酸（HAV、HBV、HCV、HIV-1、HPV B19等）和病原體抗原和抗體（HBsAg、抗HBs）等。這些標準物質均由壹些國際標準化組織和機構提供，如英國國家生物學標準和質控物研究所（NIBSC）、美國疾病預防控制中心（CDC）、美國病理學家協會（CAP）的國家委員會、國立衛生研究所（NIH）等。在國內，中國藥品生物制品檢定所和衛生部臨床檢驗中心則提供壹些相應的國家標準物質。
六、工作程序、試劑方法、標準物質和實驗室結果可比性的關系
從圖1中可見，在臨床分子診斷標準化諸要素中，標準物質是獲得具有可比性結果的前提。但光有標準物質還不行，試劑方法和工作程序的標準化，也是不可或缺的要素。標準物質作為核心，其可作為試劑方法和工作程序是否達到標準化的評價“金標準”。
試劑生產廠家通過使用標準物質對於許多缺乏參考方法的核酸、基因和蛋白等大分子的測定，使其定量具有溯源性，從而在試劑層面上保證使用不同或相同試劑的臨床實驗室間結果具有可比性。臨床實驗室使用標準物質，不但可以在試劑方法使用前，對其測定準確性進行有效的評價，而且，可以充分評價實驗室所制定的所有工作程序對保證檢驗結果準確的有效性。
圖1. 臨床實驗室分子診斷技術標準化諸要素間的關系
綜上所述，標準化是實現臨床實驗室分子診斷結果可比性的前提，而標準化並非是單壹因素，其由諸多關鍵性環節組成，核心是標準物質的研制及應用。眾所周知，壹個參考系統是由參考方法、標準物質和參考實驗室等三個方面組成的，但臨床實驗室既不可能在其日常工作中普遍使用參考方法，也不可能都成為參考實驗室。唯壹可以普遍應用的就是標準物質。標準物質的功能，壹是試劑生產廠家在制備試劑盒時，使用標準物質來保證其試劑檢測結果的溯源性；二是臨床實驗室工作人員在實際工作中，使用標準物質來驗證試劑方法、工作程序的實際有效性。這些都是保證日常檢驗結果準確性的必由之路，也是不同實驗室間結果走向有條件互認的前提。