因此，蛋白質相互作用的研究已成為蛋白質功能和機制研究中最重要的環節之壹。
另外，蛋白質相互作用的本質其實是三種力，氫鍵、分子間力(範德華力)和疏水力。因為這三種力的作用距離很短，所以我們通常認為相互作用的蛋白質壹定是相互靠近的。雖然這是壹個充分且不必要的命題，但我們經常用這個命題的逆命題進行實驗檢測。
那麽，如何研究這個問題呢？在這裏，狗哥將帶妳了解蛋白質相互作用的常用研究方法。
圖1
壹個
酵母雙雜交(Y2H)是壹項古老的技術。Stanley Fields和Ok-KyuSong利用大腸桿菌1989中GAL4乳糖操縱子的原理，開發了這種檢測蛋白質間相互作用的方法。
GAL4操縱子有兩個結構域，BD(結合結構域)和AD(激活結構域)，其中BD結構域可以結合UAS(上遊激活序列)DNA區域，AD結構域可以激活UAS下遊的基因表達。
因此，他們將GAL4的兩個結構域切割開來，使BD能與靶蛋白結合，並首先與報道基因lacZ上遊的UAS區結合。然後，需要測試與靶蛋白相互作用的蛋白與AD結構域融合並表達。如果目標蛋白質和被檢測的蛋白質能夠相互作用，那麽它們在空間上肯定會相互靠近。
這種相互作用可以使AD和BD結構域在空間上相互靠近，從而可以激活報告基因lacZ的表達，使人可以檢測到，如圖1所示。
這種方法的優點是成本低，操作簡單。這種方法壹度非常流行，可以用來篩選目標基因的相互作用蛋白，驗證相互作用，定量檢測相互作用的強度。
但缺點是所有測試的蛋白都需要與AD/BD結構域形成融合蛋白，空間構象可能會發生變化。其次，很多蛋白質的相互作用可能同時需要其他蛋白質的輔助，而這個系統無法將這些輔助蛋白質拉進來進行檢測，所以很多蛋白質的相互作用往往會被遺漏。第三，因為反應發生在真菌細胞中。
如果妳的目標蛋白質來自其他物種，這個實驗可能無法反映原物種細胞中蛋白質的真實狀態。最後，某些蛋白質可能能夠激活報告基因的表達，如轉錄因子，使這類蛋白質無法被酵母雙雜交篩選和驗證(當然，蛋白質也可以轉移到AD載體中，但仍有其局限性)。
二
熒光共定位(Fluorescenceco-localization)，在過去，這種技術壹般用於證明細胞中的蛋白質相互作用。幾年前，如果是其他物種的蛋白質，妳用酵母雙雜交系統驗證它們的相互作用。審稿人可能會說妳這個沒有反映原物種的真實情況，可能是假陽性。
這時有研究人員將這兩種蛋白與不同顏色的熒光蛋白融合，在原物種的細胞中表達。在高分辨率的顯微鏡下，如果兩種熒光出現在同壹個位置，證明它們在空間上是接近的，很可能有相互作用。但是，前面壹句話也說了，只是可能，並不能作為直接證據證明他們真的有互動。這個技術壹般是沒有辦法的時候的方法，我就不舉例了。
三
雙分子熒光互補技術(BIFC)將綠色熒光蛋白GFP分成兩段，分別與兩種待測蛋白融合。如果兩種蛋白質相互作用，GFP的兩個片段可以在空間上相互靠近，最終可以在激光的激發下發出綠色熒光，如圖2所示。
這裏的GFP也可以用螢火蟲熒光素酶熒光素酶代替，原理相同，只是熒光素酶需要有底物，發出自發熒光而不是激發光。這項技術的優勢在於可以在活細胞中進行觀察，可以用於實時監測和定量實驗。
但這項技術的空間分辨率在250nm左右，對於蛋白質相互作用來說還是壹個很長的距離，所以很可能是假陽性，融合蛋白也可能影響被測蛋白質的空間構象，導致假陽性和假陰性結果。總的來說，這種技術比前兩種要好。
圖2
四
熒光共振能量轉移(FRET)，這個技術和第三個不壹樣。
人們將目的蛋白A與青色熒光蛋白CFP融合表達，將A的可能相互作用蛋白B與黃色熒光蛋白YFP融合表達。CFP的激發光是波長為414nm的紫外光，而熒光波長是波長為475nm的藍光，恰好是475nm左右的藍光和525nm左右的黃光。如果AB兩個蛋白質相互作用。
當CFP僅被紫外光激發時，CFP發出的藍光會被YFP直接吸收，從而發出黃光，如圖3所示。如果我們可以量化CFP的藍光轉化為YFP的黃光的效率變化，那麽我們就可以檢測到這兩種蛋白質之間距離的變化。
因此，該技術不僅可以驗證蛋白質相互作用，還可以表征相互作用距離的動態變化，如蛋白質分子直接相對運動的方向和速度。例如，在這篇文章中，作者使用FRET來測量細胞在運動過程中的應力。
圖3
五
免疫共沈澱(co-IP)，這種技術，其原理是利用抗原和抗體的親和力來驗證蛋白質之間的相互作用。
人們用大的瓊脂糖顆粒或磁珠來交聯或親和抗體，然後用這個帶抗體的大顆粒來識別溶液中的目標蛋白。此時，如果目標蛋白質已經與其他蛋白質相互作用形成復合物，則含有目標蛋白質的蛋白質復合物將被這些大顆粒親和，因為抗體錨定在這些大顆粒上。
人們可以通過洗滌各種緩沖液來去除非特異性結合的顆粒，並通過離心或磁架抽吸來收集它們。此時，與這些粒子結合的蛋白質理論上是可以直接或間接與目標蛋白質相互作用的蛋白質。
通常妳在做實驗之前已經猜到了這些可能的相互作用蛋白，那麽妳可以在SDS-PAGE上運行被大顆粒拖垮的蛋白復合體。
然後可以用western-blot方法檢測這些可能相互作用的蛋白質的抗體，就可以驗證蛋白質之間的相互作用，如圖4所示。根據實驗目的的不同，免疫沈澱的方法可以有多種修改方式。
比如想驗證蛋白質之間的直接相互作用，可以選擇體外翻譯系統，在試管中合成壹對需要驗證相互作用的蛋白質，然後混合孵育，進行檢測。也可以通過原核表達系統純化這壹對蛋白，然後混合孵育，檢測。免疫沈澱的方法合理，可以玩很多有趣的實驗，可以回答很多問題。
圖4
六
親和純化-質譜(AP-MS)，剛才說了，如果妳在實驗前已經推測了目的蛋白的相互作用蛋白，可以做western-blot檢測壹下。
但是，如果妳想找到壹些以前沒有報道過，自己也猜不出來的新的相互作用蛋白呢？這時，妳可以將免疫沈澱後得到的樣品送到實驗室進行蛋白質組學質譜分析，通過質譜鑒定這個復合物的所有成員，理論上就可以得到整個目標蛋白質復合物的成員信息，如圖4所示。
如果說以前的實驗都是拿槍瞄準對面山上的敵人，那麽質譜的方法就是拿槍消滅對面山上的敵人。AP-MS方法有多種變體。
例如，通過使用壹些可以用生物素標記外周蛋白的酶，我們可以將目標蛋白與這些酶融合。然後在細胞內，這些融合蛋白可以用親和素標記目標蛋白附近的所有蛋白，再通過生物素和親和素的超強親和力，可以大大提高AP-MS鑒定的靈敏度。在洗滌非特異性結合時，我們不必擔心失去弱相互作用。這種方法被稱為鄰近標記。
茍哥幫我們整理了研究蛋白質相互作用的主流方法，我的導師再也不會擔心我的題目了。但是實驗設計還是需要嚴謹、可控、可重復性和誘餌-獵物互換等等，這些都是需要在做實驗之前仔細討論和考慮的。
最後，目前蛋白質的蛋白質組學研究方法不僅功能強大，而且高效快捷。如果妳對蛋白質的蛋白質組學方法感興趣，茍哥可以多發表文章，和妳壹壹探討。
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