中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第42卷 第12期 2011年12月
銀杏葉滴丸中萜類內酯測定方法的改進研究
黃琴偉，李櫻紅，鄭 成*
浙江省食品藥品檢驗所，浙江 杭州 310004
摘 要：目的 以銀杏葉對照提取物為對照建立銀杏葉滴丸中萜類內酯的定量測定方法。方法 采用HPLC-ELSD 法，色譜，流動相為甲醇-水（30∶70），體積流量0.8 mL/min，ELSD 檢測器，漂移柱為Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm ）
管溫度105 ℃，氮氣體積流量3.0 L/min。結果 銀杏內酯A 、銀杏內酯B 、銀杏內酯C 、白果內酯分別在1 672.2～10 033.2、1 026.4～6 158.4、527.8～3 166.8、2 200.8～13 204.8 ng呈良好的對數線性關系；銀杏內酯A 、銀杏內酯B 、銀杏內酯C 、白果內酯及總萜類內酯的平均回收率分別為100.3%（RSD 2.5%）、108.1%（RSD 3.5%）、116.0%（RSD 4.9%）、90.4%（RSD 0.6%）及99.3%（RSD 1.1%）。結論 本方法簡單易行、可控性強、重復性好，可用於銀杏葉滴丸中萜類內酯的定量測定，並為中成藥中多指標成分同時測定提供了有效的思路和解決方案。
關鍵詞：銀杏葉滴丸；萜類內酯；銀杏葉提取物；銀杏內酯A ；銀杏內酯B ；銀杏內酯C ；白果內酯 中圖分類號：R286.02 文獻標誌碼：A 文章編號：0253 - 2670(2011)12 - 2456 - 03
Improvement of assay on terpene lactones in Yinxingye Dropping Pill
HUANG Qin-wei, LI Ying-hong, ZHENG Cheng
Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310004, China
Key words: Yinxingye Dropping Pill; terpene lactones; gingko leaves extract; ginkgolide A; ginkgolide B; ginkgolide C; bilobalide
銀杏葉滴丸為銀杏葉提取物的新型制劑，具有活血化瘀、通絡作用，用於瘀血阻絡引起的胸痹心痛、中風、半身不遂、舌強語謇，冠心病穩定型心絞痛、腦梗死見上述癥候者[1]。目前銀杏葉滴丸為浙江萬邦藥業有限公司獨家生產品種，標準收載於《中國藥典》2010年版[2]。萜類內酯是銀杏葉提取物的活性組分之壹[3]。銀杏萜類內酯可高選擇性拮抗由PAF 誘導的血小板聚集，其中以銀杏內酯B 作用最強，從而降低血液黏度，防止機體組織器官缺血、缺氧[4]。銀杏萜類內酯通常以銀杏內酯A 、銀杏內酯B 、銀杏內酯C 、白果內酯為對照建立HPLC-ELSD 定量測定方法[2, 5-7]，並以此4種對照品量的總和計。為簡化操作並節省資源，本實驗以銀杏葉對照提取物為對照進行方法學考察，對原標準進行優化。 1 儀器與材料
Agilent 1200型系列高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）：包括G1311A 四元泵、G1322A 脫氣
收稿日期：2011-07-12
基金項目：國家“十壹五”科技支撐計劃（2009ZX09308-004）
作者簡介：黃琴偉（1983—），女，浙江溫州人，碩士，主要從事藥品質量分析。
Tel: [1**********] Fax: (0571)86459425 E-mail: qingwei-h@163.com
*通訊作者 鄭 成 Tel: (0571)86459414 E-mail: joeff30@163.com
機、G1329A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱、Alltech 2000ES 蒸發光散射檢測器。
白果內酯（BB ，批號110965-200404）、銀杏內酯A （GA ，批號110862-200608）、銀杏內酯B （GB ，批號110863-200508）、銀杏內酯C （GC ，批號110864-200906）對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；銀杏葉對照提取物（批號091004）由浙江康恩貝藥業有限公司提供（已標化，含GA 26.78 mg/g、GB 16.44 mg/g、GC 8.45 mg/g、BB 35.25 mg/g）。醋酸乙酯、醋酸鈉、鹽酸均為分析純；甲醇為色譜純，水為重蒸水。銀杏葉滴丸（批號100310、100311、100312、100209、100401、100402）由浙江萬邦藥業有限公司提供。 2 方法與結果 2.1 色譜條件
色譜柱為Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm ），流動相為甲醇-水（30∶70），體積流量
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0.8 mL/min，ELSD 檢測器，漂移管溫度105 ℃，氮氣體積流量3.0 L/min。理論板數按BB 峰計算
1
1
不低於2 500；GA 峰與GB 峰的分離度大於1.5。色譜圖見圖1。
A B
1
3
2
4
3
2
4
C
3
2
4
t / min
1-BB 2-GC 3-GA 4-GB
0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30
圖1 銀杏葉對照提取物（A ）、銀杏葉滴丸（B ）和混合對照品（C ）的HPLC 圖 Fig. 1 HPLC chromatograms of ginkgo leaves extract control (A), Yinxingye Dropping Pill (B),
and mixed reference substance (C)
2.2 混合對照品溶液的制備
527.8～3 166.8、2 200.8～13 204.8 ng呈良好的對數線性關系。 2.6 精密度考察
精密吸取上述對照提取物溶液10 μL ，重復進樣5次，記錄峰面積，GA 、GB 、GC 、BB 峰面積的RSD 分別為0.2%、0.4%、0.5%、0.1%，表明儀器精密度良好。 2.7 穩定性試驗
取批號100310樣品制備供試品溶液，分別在0、4、10、16、24、30 h時註入色譜儀，記錄GA 、GB 、GC 、BB 峰面積，結果GA 、GB 、GC 、BB 峰面積的RSD 分別為0.5%、1.2%、0.7%、0.2%，表明供試品溶液在30 h內穩定。 2.8 重現性試驗
取批號100310樣品約0.5 g，***6份，按供試品溶液制備方法操作，註入液相色譜儀，依法測定，結果總萜類內酯量的RSD 為2.3%，GA 、GB 、GC 、BB 的RSD 分別為2.4%、3.0%、2.8%、1.5%。 2.9 加樣回收率試驗
按供試品溶液制備方法，取同壹批樣品（批號100310）各約0.25 g，***6份，加入已標化的銀杏葉對照提取物各約0.1 g，註入液相色譜儀，依法測定，計算回收率和RSD 。結果表明，GA 、GB 、GC 、BB 及萜類內酯的平均回收率分別為100.3%、108.1%、116.0%、90.4%、99.3%，RSD 分別為2.5%、3.5%、4.9%、0.6%、1.1%，回收率符合要求。 2.10 樣品測定
取6批樣品各約0.5 g，按供試品溶液制備方法操作，註入液相色譜儀，依法測定，參考《中國藥
分別精密稱取GA 、GB 、GC 、BB 對照品22.47、18.97、10.25、19.60 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇使溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。 2.3 供試品溶液的制備
取銀杏葉滴丸20丸，研細，混勻，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水20 mL、2%鹽酸溶液4滴、醋酸乙酯20 mL，加熱回流30 min；冷卻至室溫，轉移至分液漏鬥，分取醋酸乙酯液，水液再用醋酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合並醋酸乙酯液，用5%醋酸鈉溶液20 mL萃取，分取醋酸鈉液，用醋酸乙酯20 mL萃取，合並醋酸乙酯液，用水洗滌2次，每次10 mL，分取水液，用醋酸乙酯20 mL提取，合並醋酸乙酯液，蒸幹，殘渣用甲醇溶解並轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
2.4 對照提取物溶液的制備
取已標化的銀杏葉對照提取物0.15 g，精密稱定，照供試品溶液的制備方法，同法制成對照提取物溶液。
2.5 線性關系考察
精密吸取上述對照提取物溶液2、4、6、8、10、12 μL ，分別註入高效液相色譜儀，以進樣量的對數值為橫坐標（X ），峰面積的對數值為縱坐標（Y ）進行線性回歸，得回歸方程：GA Y ＝1.249 X －2.721 5，r ＝0.999 2；GB Y ＝1.421 6 X －4.629 1，r ＝0.999 4；GC Y ＝1.646 2 X －3.687 3，r ＝0.999 6；BB Y ＝r ＝0.999 4；表明GA 、GB 、GC 、1.257 4 X －1.986 1，
BB 分別在1 672.2～10 033.2、1 026.4～6 158.4、
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[1]典》萜類內酯的量以GA 、GB 、GC 和BB 總量計，
察了漂移管溫度、氮氣體積流量，結果表明漂移管溫度為105 ℃、氮氣體積流量為3.0 L/min，響應值最大。
本實驗同時采用常規的混合對照品法測定了6批樣品中總萜類內酯的量，經對比，兩種測定方法所得結果的相對平均偏差依次為0.9%、0.8%、0.4%、1.3%、0.0%、1.2%。
本實驗為使標準更加科學簡便，對萜類內酯的結果見表1。
表1 銀杏葉滴丸中總萜類內酯定量測定結果 (n ＝2)
Table 1 Determination of terpene lactones
in Yinxingye Dropping Pill (n = 2)
批 號
總萜類內酯/(mg·丸?1)
銀杏葉對照提取物法
混合對照品法
100310 1.11 1.09 100311 1.17 1.19 100312 1.23 1.24 100209 1.20 1.17 100401 1.20 1.20
100402 1.25
1.28
3 討論
參考《中國藥典》2010年版[1]“加10 mL水，溫熱溶解”，結果發現有部分殘渣不能完全溶解，故本實驗考察了供試品溶液的提取條件，結果表明，20 mL，……，加醋酸乙酯20 mL，加熱回流30 min”，可解決殘渣難溶的問題，同時將每次醋酸乙酯的用量增至20 mL，可避免乳化。
本實驗比較了正丙醇-四氫呋喃-水
[4-6]
和甲醇-
水[8-9]兩種流動相系統，經試驗，發現兩種系統下4種銀杏內酯均能在30 min內達到基線分離，考慮到正丙醇和四氫呋喃均為不常用的試劑，特別是四氫呋喃，毒性和刺激性均較大，綜上考慮，故將流動相制定為甲醇-水（30∶70）。
本實驗曾於25、30、40 ℃的柱溫條件下考察了色譜峰的分離效果，結果各色譜峰均能有效分離；另考察了Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm ）、Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm ）、Kromasil 100-5 C18色譜柱250 mm×4.6 mm，5 μm ），結果3種色譜柱均適用於該分析方法，說明本方法有較好的耐用性。
本實驗對蒸發光散射檢測器參數進行優選，考
前處理方法和液相色譜流動相系統進行了改進；為節約對照品和化學試劑的用量，采用銀杏葉對照提取物進行定量，為中成藥中多指標同時的測定提供了有效的思路和解決方案，為節省中藥對照品，降
低實際檢驗成本都有很大的益處。 參考文獻
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“加水（