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溶菌酶粗提實驗中,為什麽蛋清緩沖液的PH先調至4.7,再調至8.0?

因為卵清蛋白的等電點是4.7,為了純化溶菌酶,要沈澱卵清蛋白,所以要調PH到4.7。至於8.0,這是溶菌酶的最適PH值。

溶菌酶的提取方法:

樹脂預處理:將幹樹脂用清水浸泡,使其充分膨脹,去除細小顆粒和較大雜質;將1 mol/L HCl浸泡2 h,用去離子水沖洗3次至近中性;抽濾收集樹脂,用1 mol/L NaOH溶液浸泡2 h,用去離子水洗滌3次至近中性;過濾收集樹脂,加入pH值為6.5的0.1.5 mol/L磷酸緩沖液平衡過夜備用。

蛋清的制備:將三個新鮮雞蛋洗凈晾幹,在小端打壹個小洞,在大端打壹個小洞進氣,分離蛋清,用1 mol/L HCl調PH至7。過濾前稱取燒杯48.7g,緩慢攪拌,用滅菌的兩層紗布過濾,去除臍帶片和碎蛋殼。蛋清和燒杯的總重量是207.5克,蛋清的凈重是158.8克..用1 mol/L HCl溶液調節pH值至7.0,蛋清體積為100 ml。調節PH時,蛋清中出現少量白色沈澱,可能是部分蛋白質因局部酸性而變性。

吸附:在不斷攪拌下向蛋清中加入25g過濾後的724樹脂(相當於蛋清體積的四分之壹),在冰水浴中用磁力攪拌器緩慢攪拌(使樹脂完全懸浮在蛋清中,攪拌後不起泡),吸附2.5 h,4℃靜置65438±0.5h,然後以3000r/min離心65438±05min,分層,收集樹脂,回收蛋清(樣品A)。

去除雜蛋白:將收集的樹脂用去離子水沖洗至洗液澄清(直至無泡沫),用吸管輕輕吸去洗液中的雜蛋白。(每次洗滌1次,離心1次,共***3次)在冰浴中,用同體積pH =6.5的0.15mol/L磷酸緩沖液攪拌洗滌15min,過濾,重復洗滌三次,註意防止樹脂流失。最後壹次,用抽濾把樹脂裏的水過濾掉,直到幹為止。

溶菌酶的洗脫:向樹脂中加入35ml(等體積)10% (NH4) 2SO4溶液,攪拌洗脫30 min,過濾將溶菌酶從樹脂上洗脫下來,重復兩次,合並收集洗脫液(留樣),洗脫液過濾後,精確量取100ml的體積。(樣品保留b)

鹽析:每83mL洗脫液中加入32g磨細的固體(NH4)2SO4,本實驗總量為38.55g,緩慢加入(NH4)2SO4,攪拌至完全溶解,用保鮮膜密封,置於4℃冰箱中鹽析過夜。

透析:分離出白色沈澱後,以3000r/min離心65438±05min,收集沈澱,用去離子水洗滌至完全溶解(4.5ml去離子水),置於透析袋中,用去離子水(冰浴)透析,期間更換去離子水兩次,直至BaCl2完全檢測到透析。將磁體添加到透析裝置中,並在磁力攪拌器中攪拌以加速透析。

雜質蛋白去除:從透析袋中取出透析液,用0.1mol/L HCl調節pH至pH4.6,產生少量白色沈澱(留樣D),可能是雜質蛋白。以3000轉/分鐘離心65438±00分鐘,收集上清液(C 20ul)。

濃縮:用PEG-20000將上清液濃縮至1.5ml(樣品E,20ul,加入上樣緩沖液,黃色(可能是濃縮時PEG-20000滲入透析袋)。[5][6]

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