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石房蛤毒素的檢測方法

在食品衛生安全方面,隨著海洋環境的惡化和大量赤潮的發生,世界更加重視對貝類中毒的檢驗。美國從1925開始建立貝類中毒的監測體系。1958後,貝類產地STX允許量為80μg/100g(相當於400MU/100g)。日本和加拿大也有類似的規定。飲用水中STX及其類似物的健康警戒線為3微克/升。

生物檢測方法包括:(1)生物毒性試驗法。小鼠生物測定法是AOAC推廣的檢測麻痹性貝類毒素的標準方法,也是唯壹國際認可的方法。這種方法在檢測樣品的總毒性方面相當成功,但它不能準確表征樣品中的單壹毒素。此外,還有家蠅和蝗蟲的生物分析。上述三種生物分析技術的原理是相似的。(2)細胞毒性試驗。文蛤毒素具有Na+通道阻斷劑的特性,可拮抗毒蠅堿和藜蘆堿的作用,從而減輕或“拯救”細胞形態的改變和細胞裂解死亡,拮抗或“拯救”作用與毒素的量是相對應的。根據這種對應關系,可以計算出毒素的含量。早期建立的方法是用顯微鏡計數活細胞數來檢測PSP毒素的量,但試驗時間長,操作復雜,所需細胞量大。基於這壹原理,研制了STX快速診斷裝置MIST,並成功地用於測定PSP的總毒性以及STX、neoSTX、GTX和dcSTX的相關毒性。該裝置靈敏度高,檢測快速,不需要組織培養設備和專業知識。(3)免疫分析技術。隨著抗STX抗體的獲得,血凝反應、放射免疫分析、酶聯免疫吸附分析等免疫分析技術逐漸發展起來,其中直接競爭ELISA是最常用的方法,檢測限可達3pg/ml,間接ELISA的檢測限也可達10pg/ml。免疫法靈敏、方便、快速,但關鍵是獲得抗體,各毒素交叉反應低,不能全面反映樣本的毒源。(4)受體分析。即固相受體結合分析法是基於PSP毒素能與Na+通道蛋白結合的特性,通過同位素標記檢測PSP類毒素的量,快速、可靠、準確。Llewellyn等人將Na+通道蛋白替換為特異性結合STX的轉鐵蛋白樣Saxiphilin,該蛋白對STX的鑒定具有特異性,從而將其與TTX的鑒定區分開來。

儀器測定方法包括(1)HPLC法及其聯用技術。高效液相色譜法靈敏度高、特異性強、檢出限低、分析時間短,能提供更多的毒素信息,是毒素檢測的主要手段。而石房蛤毒素分子本身的發色團很弱,很難被檢測到,所以檢測前要將其氧化成熒光發色團,用熒光檢測器檢測。氧化方法主要有柱前氧化和柱後氧化,柱後氧化在分離柱後的附加柱上進行,簡化了操作步驟。隨著質譜技術的發展,液相色譜-質譜聯用(LC-MS)已經成為物質鑒定的有力手段。(2)薄層色譜法。TLC法是檢測PSP毒素的傳統方法之壹,已較少使用。然而,新型檢測設備的出現為其發展提供了新的空間。我在色譜柱上用棒狀薄層色譜法分離STX及其同系物,並用火焰熱離子檢測器(FTID)檢測。結果STX的檢出限為5ng,其他同系物的檢出限也達到ng級。另外,氣相色譜法、離子交換柱色譜法、電泳法都是檢測STX毒素的傳統技術,其優缺點各不相同。小鼠生物測定法(MBA)是在STX被鑒定出來之前發展起來的壹種檢測方法,其他的檢測方法都以這種方法為參照。MBA用於檢測STX由來已久,是AOAC在1958中確認的法定檢測方法。大多數國家仍在使用這種方法。該方法技術簡單可行,不需要特殊設備。大鼠神經細胞對STX的反應與人神經細胞相同,因此該方法的測定結果直接關系到對人體健康的風險評估。大多數國家規定海洋貝類產品中STX的最大可接受含量為80μg STXeq/100g,墨西哥控制在30μg STXeq/100g,菲律賓控制在40μg STX eq/100g。但也有人認為80μg的檢測限STXeq/100g可以保證人體健康不受威脅。這些毒素在飲用水中的含量也不同。1999年,研究人員通過實驗計算出飲用水中PSTs的最大可接受含量為3μg STXeq/L。後來,澳大利亞將該濃度應用於飲用水標準,巴西將其作為強制性法律標準,新西蘭將該濃度作為飲用水的最大可接受含量。而MBA對這個濃度不夠敏感,沒有濃度的樣品很難檢測出來。MBA的最低檢出限為40μg STXeq/100g,相當於0.2μg/mLSTX或200μg/L STX。因此,雖然MBA已被廣泛用於檢測生物富集後海產品中的STX含量,但它不適合檢測飲用水中的STX含量,也無法準確表征樣品中的單壹毒素,而且實驗動物檢測方法在部分地區已被禁用。針對這些問題,逐漸發展了壹些檢測貝類中毒的新方法,如化學、生物化學、毒性測定等,也可用於淡水藍藻和汙染水源的檢測。

建立了細胞生物測定法檢測PSTs的含量,可以代替MBA進行毒性檢測。這種方法專門用於檢測毒素,如STX,它可以阻斷電壓門控Na+通道。神經瘤細胞分析是在神經細胞的鈉離子通道水平檢測PSTs。STX是壹種Na+通道阻斷劑,其功能可以通過與打開鈉通道的藜蘆堿的拮抗作用來檢測。首先建立了細胞生物測定法,以小鼠神經母細胞瘤的形態學為終點來評價結果,後來Jellet和Manger對該方法進行了改進,用比色法顯示了更好的選擇性。因此,如果實驗室能夠負擔得起基於MS的檢測方法的儀器成本,那麽這種檢測方法很可能在未來取代STX的色譜分析。細胞的活性用終點來衡量,這樣更容易自動控制。在該方法中,在96孔細胞培養板中培養神經瘤細胞,並用Na+通道激活劑藜蘆堿處理,以增強Na+和Na+/K+-ATP酶抑制劑ubenin的內流,從而阻斷Na+的外流。在PSTs的存在下,通過使用MTT (3-[4,5-二苯基-2羥基]-2,5-二苯基四唑)測定細胞生存力。利用藜蘆堿和烏貝寧的標準量,可以將細胞保護的程度與PSTs的標準量進行比較,從而量化PSTs的總量,然後將結果換算成STX當量。小鼠和人成神經細胞瘤細胞均可用於該試驗。

Saxiphilin是壹種與轉鐵蛋白結構相似的蛋白質。研究表明它與PSTs有很高的親和力。然而,不同的Saxiphilin對不同的類似物具有不同的親和力。迄今為止,從熱帶蜈蚣中分離出的虎耳草素在實驗中的選擇性最低。利用這壹特性,Llewellyn LE等人建立了檢測PSTs的特異性受體法,該方法的檢出限為6.3μg STXeq/L,即1.3μg STXeq/100g貝類。然而,研究人員表示,如果在沒有額外基質幹擾的情況下增加樣本量,這種方法的檢測限將會降低。從熱帶蜈蚣中提取巖黃連素粗品的過程非常簡單,制備的產品非常穩定,可反復凍融,在-80℃下可保存壹年以上。編碼Saxiphilin蛋白的基因克隆和文庫構建已經完成,該蛋白可以在真核表達系統中表達,獲得的表達產物具有生物活性。進壹步的研究已經證明,同時使用SCBA和Saxiphilin受體檢測方法來檢測介形類和貝類中非PSTs鈉通道的活性是可行的,因為非PSTs如河豚毒素(TTX)不與Saxiphilin結合,並且檢測結果與HPLC和MBA的結果有很好的相關性。

這種方法最初用於監測貝類和魚類產品中的海洋毒素,並在檢測海洋神經毒素方面得到了很好的驗證。其他研究者也用這種方法檢測了淡水藍藻中占優勢的PSTs的衍生物,進壹步驗證了這種方法。結果表明,神經細胞瘤生物測定結果與小鼠生物測定結果非常接近(相關系數R2=0.96),且具有靈敏度較高的優點,其檢測限為10ng STXeq/mL提取物(相當於2.0μg STXeq/100g貝類)。細胞生物測定法得到的結果與色譜法得到的結果也有很好的相關性。然而,生物測定有其獨特的優勢,即它對任何能抑制Na+通道的毒素都具有良好的敏感性,無論是已知的PSTs類似物還是未知的變體。正如Humpage等人所描述的,這種方法可以檢測到許多未被鑒定和無法通過色譜法檢測到的毒素。細胞生物測定法不能區分相似毒素,只能提供所有毒素的壹個累積效應值,所以與MBA相比,在細胞培養測定中很難確定相關毒素類似物的毒性反應,除非對每個類似物進行單獨分析。然而,Llewellyn等人提供的數據表明,當使用復雜的PSTs混合物時,細胞生物測定比MBA更能預測毒性。Llewellyn等人還利用MBA、細胞培養測定法、HPLC和放射性受體測定法分析了21種含有復合PST的貝類提取物。在這四種檢測技術中,與MBA相關的細胞培養化驗結果最接近預期毒性。然而,細胞生物測定法仍然存在壹些缺點。首先,由於該方法依賴於藜蘆堿和烏貝寧的拮抗作用,因此需要使用合適的濃度使其對PSTs敏感。如Jellet等人所討論的,毒素濃度的任何變化都會降低該方法對PSTs檢測的靈敏度。其次,這種方法的標準檢測裝置運行緩慢,需要較長的細胞孵育時間(24-48 h)才能對神經母細胞瘤細胞形成細胞毒作用。高效液相色譜法廣泛應用於有機化合物的分離,也是檢測PSTs的第壹種儀器分析方法。但該技術也存在壹些不足,如需要毒素標準品作為參考,缺乏制備熒光產物的光反應酶或柱後衍生載體,特別是PSTs在樣品制備過程中可能發生化學轉化。這種轉化往往會將低毒毒素變成劇毒毒素,使得無法確定原樣品中毒素的真實毒性。因此,毒素的變異促進了檢測方法和更精確的提取和分離方法的發展。STX最早的理化檢測方法是由Bates和Rapoport提出的。由於缺乏STX的顯色載體,這種方法只能在堿性環境下用過氧化氫將STX氧化成熒光化合物來達到檢測的目的。當時人們認為該方法的靈敏度高於小鼠生物法,建議將該方法用於貝類樣品的常規檢測。然而,這種方法非常復雜,使用幾種溶劑和超過10個化學過程。他們改進了這種方法,增加了準確性和可重復性,但這種方法的操作仍然非常復雜。

20世紀80年代,許多研究機構利用X射線衍射、薄層色譜-熒光檢測和高速液相色譜(HSLC)等方法發現了新的化合物。1975年,清水等人首先描述了gTX1,GTX2,gTX3的存在。用葡聚糖凝膠G或bio-gel P-2聚丙烯酰胺凝膠柱從gTX中分離STX,然後用HSLC將gTX的峰值分解成三種不同的毒素。1987年,Oshima及其合作者開發了柱後氧化法,可以詳細分析天然甲藻、水華、貽貝、牡蠣等提取物中含有的PSTs。與Oshima的柱後氧化法相反,Lawrence等人開發了壹種使用柱前氧化產生熒光PSTs衍生物的液相色譜法。他們證明過氧化氫氧化對非羥基化毒素的分析更敏感,而高碘酸鹽氧化對羥基化毒素的分析更敏感。在此期間,他們改進了這項技術,如在高碘酸鹽氧化劑中加入甲酸銨,從而改善了neoSTX、GTX1、B2和C3的分析結果,在流動相中加入這種化合物使neoSTX和B2的色譜分析更好。由於pH值對測試結果影響很大,研究人員在測試過程中控制了pH值。當Gago-Martinez使用柱前法時,高碘酸鹽和過氧化物氧化過程的pH值分別調整為7.2-12和8.2-12.8,熒光氧化產物的最終產率不同。當pH為8.2時,neoSTX的產率通過高碘酸鹽氧化達到最大值,而當pH為10-11.5時,STX、GTX2/3、dcSTX和gTX5的產率也達到最大值。Lawrence等人宣稱通過柱前氧化很容易控制pH,因此結果的可重復性更好,因為柱後氧化過程中pH變化很小,對熒光標記產物的產率影響很小。然而,盡管柱前方法相對簡單,但壹些PST形成相同的氧化產物,而另壹些PST形成壹種以上的熒光產物。建議將此方法作為壹種篩選方法,為監測項目服務。原方案是先用高碘酸氧化法。當檢測到大部分PSTs且毒素濃度超過常規檢測限80μg STXeq/100g時,則采用過氧化氫氧化。色譜氧化已被用於檢測貝類毒素和研究PSTs在大鼠腦不同區域的分布。他們認為這種方法非常合適,靈敏度也很高,因此被確定為歐洲國家PSTs的官方檢測方法之壹。然而,Ben-Gigirey等人進行了實驗室研究,並得出結論:雖然這種方法適用於檢測研究,但在分析含有更復雜毒素的樣品時獲得的結果並不理想,它並不是對所有PST都有效。另外,該方法僅針對STX、GTX2/3、dcSTX、dcGTX2/3等毒素類似物,可獲得滿意的檢測結果。Turner等人利用該標準進壹步驗證了Lawrence的方法,包括其選擇性、線性、檢出限、準確度、回收率、準確度、重復性和適用性,以及添加了諸如dcNeoSTX和dcGTX2/3等PST。Turner等人對這種方法進行了改進,增加了氧化產物的穩定性,提高了固相離子交換的純度,最後得出結論,這種方法可以得到滿意的結果。

液相色譜-質譜聯用(LC-MS)是壹種有效的檢測技術,可用於鑒定未知化合物,定量已知物質,闡明新分子的化學性質和結構,實現高靈敏度、高選擇性、準確定量和高通。但是LC-MS價格昂貴,需要專業的技術人員進行操作和維護。盡管如此,Quilliam建議將LC-MS檢測方法作為檢測海洋毒素的常用方法。質譜檢測PSTs的挑戰之壹是離子對試劑會幹擾目標化合物的電離,因此離子對試劑應具有高效的PSTs反相色譜。因此,Jaime等人開發了壹種色譜方法,基於非離子成對洗脫和柱後電化學氧化,采用陰陽離子交換柱串聯。Dell'Aversano等人開發了壹種實用的親水液相色譜,不僅可以分離主要的PSTs,還可以從藍藻中分離甲醛類毒素、柱狀毒素等。使用該方法,在質譜儀運行選擇性反應監測程序時,檢測到15種PST並鑒定出新的毒素類似物。Diener和他的合作者分別使用兩性離子親水作用色譜結合質譜和熒光檢測在單壹梯度下檢測PSTs。他們得出結論,這兩種方法都可以獲得可靠的定量結果,並且可以很好地分離更多相關的PST。這兩種方法的檢測限只是略有不同,熒光檢測器的靈敏度更好,而MS檢測器運行時間更短,如受體結合分析法(RBA)、免疫學分析技術等。隨著科學技術的發展,壹些新的研究方法被應用於STX及其類似物的檢測,如生物傳感器法、色譜-質譜、熒光定量PCR等。由於ELISA具有靈敏、快速、操作簡單等優點,已被廣泛應用於檢測領域,尤其是在醫學和食品檢測領域。這種技術的挑戰是保持其識別目標物質結構多樣性的能力,同時在檢測相關化合物(如PSTs)的混合物時忽略復雜基質中其他化合物的影響。對此,Usleber等總結了建立抗體檢測技術的研究進展。研究表明,抗STX抗體與neoSTX有微弱的交叉反應,這種選擇性可應用於該家族的所有類似物。Chu等發現基於抗STX抗體的檢測與基於抗neoSTX抗體的檢測之間存在弱相關性。綜合兩次檢測結果,雖然檢出率有所提高,但仍然不高,只有MBA的80-85%,陽性結果較低。Kawatsu等人建立了針對gTX2/3的單克隆抗體,以改善先前建立的針對STX和neoSTX的抗體。該抗體不同於STX/neoSTX家族中的其他抗體,但與gTX2/3、dcGTX2/3和C1/2具有相似的親和力。Garthwaite等人對多種檢測方法進行了深入研究,並建議使用壹套完整的ELISA,不僅可以檢測貝類樣品中的PSTs,還可以檢測健忘癥貝類毒素、腹瀉性貝類毒素和神經毒性貝類毒素。熒光定量PCR Al-Tebrineh J等人建立了壹種特殊的SYBRgreen定量PCR方法,用於定量檢測魚腥藻藍細菌產生的STX。這種方法主要是通過測定藍藻中鑒定的STX基因簇中獨特的多乙酰基序列的拷貝數來推斷樣品的毒性。Al-Tebrineh J等人用這種方法檢測了從澳大利亞不同地區的湖泊、水庫和河流中采集的水樣,通過HPLC和顯微細胞計數測定了水中STX的富集情況和藍藻的細胞密度。實驗證實,STX富集確實與STX基因的拷貝數有關,這意味著後者可以作為衡量魚腥藻和其他藍藻毒性潛力的方法。定量PCR靶向的STX基因也可用於監測魚腥藻和其他幾種藍細菌產生STX的能力以及用於生態生理學研究。

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