1.提取質粒時，最後壹步的酒精揮發很重要，基本上是其後續消化反應的決定性因素。所以這壹步盡量長時間揮發，最好用空調吹熱風或者長時間放在37度培養箱裏。我試著在室溫下過夜，酶消化的很好。
2.緩沖液和培養基的配置
1)將緩沖溶液配方中的各組分分別按10-100的比例制成母液儲存，需要時只需將相應的母液用水混合稀釋即可。
2)配制培養基時，通常會忘記各組分的用量。比如配制LB時，三種成分記不清哪個是5g，哪個是10，所以常用試劑瓶的標簽上可以註明需要的量。比如配制LB時，NaCl瓶外註明10g/L，YEAST5G/L，TRYTON 10g/L等等。
3.關於PCR主反應液的配置:
在做克隆鑒定時，往往需要先進行PCR鑒定，再進行酶切鑒定。每次配置PCR反應液都很復雜。妳可以按照妳需要的反應體系列表，用類似於kit的形式配置，然後配置主反應液(100倍)，主反應液含有緩沖液、Mg2 ++和dNTPs，但不含引物和Taq。然後可以10×包裝或-20℃保存於試管中，必要時取出融化，然後根據所需PCR反應次數吸收相應倍數，再加入相應反應倍數的Taq和引物，混勻後包裝。這樣做的優點如下:
1)可以大大節省寶貴的時間，可以收工看球了。
2)避免每次反應上樣不均勻的可能性。
PCR的假陽性大大降低。
4.用於酶消化的反應溶液的配置:
做酶切的時候，主反應液也可以像PCR壹樣配置。在每個反應之前，列出反應系統，並計算所需的反應次數。然後根據所需反應體系，放大所需反應次數，加入緩沖液、酶和水。質粒柱是空的，然後按照除質粒DNA以外的體積混合分裝，然後在每個試管中加入相應體積的質粒DNA進行酶切。這種方法的優點如下，特別是當有10個陽性克隆要同時鑒定時:
1)反應組分均勻。
2)可以大大減少限制性內切酶的使用。
3)節省時間
5.確定蛋白是否在大腸中表達，壹般需要在誘導前後對樣品進行蒸煮檢測，但很多情況下蒸煮後的樣品有粘性，影響凝膠運行效果。我發現如果在烹飪前用8尿素重懸細菌，效果會大大提高。
註意:不能用鹽酸鎵代替。
6.超濾最適用於蛋白質濃縮、緩沖液置換和脫鹽，但按分子量初步分離的效果不是很好，理論和現實相差很大。
7.有時候當我們想沈澱壹些東西的時候，因為沈澱量很少，離心後不知道有沒有什麽東西沈澱，所以建議在離心的時候把離心管放在特定的方向(比如EP管蓋放在同壹個方向)，這樣妳就可以在離心之前確定沈澱的大概位置。另外，在看降水的時候，可以對著光看，這樣甚至可以看到顆粒狀的細小降水。
8.每個人都知道PMSF有劇毒。過去，在知道濃度和要準備的體積的基礎上，我們計算要稱多少毫克PMSF。事實上，我們也可以先稱量PMSF，然後調整異丙醇的體積，以達到您想要的濃度。這樣可以防止妳長時間接觸它。(也就是說，妳可以改變溶劑的體積，匹配質量，使最終濃度不變。)
9.用酶標板加樣時，蛋白質樣品往往會產生大量氣泡。做熒光實驗的話，因為靈敏度非常高，壹點點微小的氣泡都會有很大的影響，加上消泡劑往往是不行的，所以我會用衛生紙，撕掉。
壹小塊，搓成小針，碰到泡泡就會破，很好。(管家建議還可以準備壹根小針。打火機稍微加熱，氣泡壹碰就會破。壹般壹次可以搓幾針。如果系統可以離心，瞬時離心是最好的。) 10.酶切或PCR體系混合後，大家會用手指輕彈EP管底部，使溶液混合均勻，經常會出現很多氣泡。這時候輕彈液面以上的管壁就很容易消除氣泡。千萬不要在液面下彈跳，氣泡會越來越多。
11.磁珠回收時，不要貪多，只收集上層即可，這樣對DNA的純度和質量影響太大，對鏈接和轉化都有影響。
12.各種緩沖液必須完全融化後才能使用，而且不管什麽藥，如果只剩下最後壹點底子，妳最好放棄，因為可能會影響妳的實驗。
13.開始之前，壹定要想清楚，盡量把自己想做的事情列出來。
14.壹定要寫1，2，3...在妳做之前先做筆記，然後壹步壹步地跟著筆記做，否則妳很容易出錯。關哥想說，師弟師妹們要好好幹，哈哈。
15.酶、dNTP、水等。如果可以重新包裝的話，最好重新包裝。萬壹汙染了，就都完了。(管家哥提醒我，這個很重要。)
16.已經準備了壹批感受態細胞，最好馬上轉化壹個已知的質粒。同時，將少量感受態細胞接種到含有抗性的固體/液體培養基中進行培養作為對照。這樣第二天就可以知道這批感受態中是否有外源質粒，也可以知道這批感受態的轉化效率。如果合格，以後就可以放心使用了！
17.在做克隆點樣的時候，我們可以先將沾有細菌的牙簽點在有相應抵抗力的平板上，再扔進試管裏，做好標記，再培養壹會兒，等它長成更大的菌落後再收集。妳以後需要哪個細菌，就在盤子裏挑吧。這樣方便快捷，還能保證細菌的壹致性。
18.提取質粒時，應加入SloutionII和III並輕輕混合。個人覺得沒必要，只要不是很激烈就可以混的很快。特別是可以壹次提取多個質粒，可以快速，效果壹點都不差。
19.提取質粒時，用無水乙醇沈澱的時間可以由實驗操作者決定，如果時間足夠可以是30分鐘，或者8-10分鐘。至於溫度，我個人認為-20度比常溫好。如果加入乙酸鈉，會更容易形成鹽雜質，所以時間越短越好！
20.不知道大家都是怎麽做酶消化的。我的經驗是，在消化質粒的時候，兩種酶進行單酶消化的效果要比直接雙酶消化的效果好很多(管家提醒，這個要看系統不同)。我曾經用雙酶切過，兩次連接失敗。後來我壹步壹步用單酶切，連接效率差不多100%。
第壹種酶切完後，可以直接對體系進行熱滅活(根據酶說明書，壹般是65度20min)然後直接加入第二種酶。
或者將第壹個切開，用氯仿提取，提取蛋白質。
或者中間做壹次回收，這個會考慮回收效率和損失，但這是去除蛋白質最徹底的方法。
21.任何試劑的反復凍融對其效率都有很大影響。所以，買來的試劑在第壹次使用時，要註意按照每次實驗的劑量進行包裝和存放。提取的模板或純化的樣品也應分開存放，以防發生意外。
在大家的留言中，涉及最多的是關於蛋白質電泳(愛的深責)，管家單獨列出:
1.運行頁膠時，采用低電壓運行，可以避免高電壓產生的熱量導致膠層變形。低壓泳道會比高壓泳道跑得更直，分離效果更高，有利於分子量相近的蛋白質的分離。
2.在做WESTERNBLOT時，人們往往會摸索壹抗和二抗的濃度、封閉時間、暴露時間等。，而且每改變壹個條件，都要重新跑膠，轉膜，甚至重新提取蛋白，會浪費很多。
時間。其實這完全沒有必要。第壹次膜轉移後，PVDF膜幹燥，切成小塊，存放，使用時取出，沒有任何影響。這為正在摸索條件的同誌節省了大量時間。
3.SDS-PAGE的復膜膠和分離膠可以大體積配制，比如100ml，4度冰箱保存(註:10% AP，TEMED不加，切記！！！)，每次配置的時候只需要吸取相應體積的預制膠加入AP和TEMED中，這樣每次制膠的時候翻分子克隆特別方便。而且這樣的預成型膠可以保存半年以上，是偷懶的絕佳方式。更重要的是，可以大大減少與丙烯酰胺的接觸，從而大大降低中毒的幾率。
4.雖然電泳時小電泳的分離效果更好，但是2個多小時的等待時間確實很痛苦，所以可以把電泳提高到150V，但是需要把整個電泳槽放在裝滿冰水的盆裏散熱，這樣跑出來的膠的分離效果不比低電壓差。關鍵是大大節省時間，不用1 h就能看到結果。
5.做SDS-PAGE的時候，除了蛋白量相同之外，體積最好相同，這樣膠的泳道之間的條帶可以是壹樣寬的，方便後期對比，尤其是WB。這樣做的方法是用1X的樣品緩沖區完成同體積的待加樣品，否則會有寬有窄，尤其是樣品體積相差較大。
6.蛋白膠做成幹膠時，經常會因為氣泡而開裂。我的經驗是，在加膜之前，膠水多加水，不容易起氣泡。還有高溫烘焙(管家提醒慎用)。我喜歡放在60度的烤箱裏，這樣水分蒸發很快，即使有壹些小氣泡也不會影響。呵呵，這是我的經驗，從來沒有錯過。
7.現在壹般用SDS-PAGE跑膠，但膠要>；1h，所以如果想第二天睡懶覺不耽誤膠水跑，可以前壹天晚上集中精力把膠水分開。凝固後不要拔梳子，從制膠罐中取出帶膠的玻璃板，用保鮮膜包好。註意玻璃板上下邊緣會有氣體，需要加壹點電泳緩沖液，避免膠水中的水分蒸發。然後靜置4小時。第二天直接拔梳子隨訪。很多外企。
8.配制分離膠或非變性膠時，凝膠化過程中的收縮可能導致加樣孔較淺。可以4度放殘膠降低凝固速度，37度放凝膠促進聚合，隨時用4度殘膠補充掉的膠面。
9.制作westernblotting轉印膜時，將膠水放在轉印膜的緩沖液中壹段時間，待膠水在含甲醇的緩沖液中幾乎收縮後，安裝改膜裝置。我的體驗是，把膜印在膠水上，把預染的maker條直接畫在膜上，很方便。因為很多時候跑電泳的時候，膠水上的預染標記很清晰，但是轉膜之後就不清晰了。但需要註意的是，預染制件塗色後，膠和膜不要反方向運動，以防制件失去參考價值。
10.電器的清潔非常重要。在開始做之前，為了安全起見，尤其是灌了膠的厚薄玻璃板，可以用中性洗滌劑和自來水反復沖洗，確保沒有洗滌殘留，然後用蒸餾水沖洗2-3次，再用去離子水沖洗壹遍。最後再用95%的酒精擦拭壹遍，晾幹備用。
11.最好現在就準備膠水。先準備下層膠(分離膠)再準備上層膠(濃縮膠或層壓膠)，在倒膠前加入APS並快速混合，即以移液管吸註1-2次。(管家提醒，有可能的話最好現在就用。如果配了板，最好盡快在2天內用完，註意密封保鮮膜。)
12.運行蛋白page的時候，壹開始用加樣針太麻煩了。發現用20ul槍+普通小白槍采樣非常方便。另外，有可能妳點樣品的時候看不清楚孔在哪裏。看著離妳很遠的膠水，小孔反光。點樣，把膠水點在妳對面，這樣就省了總弓。幹我們這行的人很容易得頸椎。照顧好妳自己。
13.在立式電泳中，可以將青黴素小瓶放入電泳槽中，在不影響電泳的情況下自然提高液面，節省電泳緩沖液。(關家兄弟沒試過，慎用。)
14.不要反復混槍，稍微晃壹下就好。多次混槍會導致凝膠化不良，影響電泳圖譜的分辨率。
15.AP分成500微升，保存在-20度的壹個試管中，避免AP使用時間過長而失效。
16.倒膠時盡可能用濾紙吸幹玻璃板中的水，因為微量水的存在會影響膠水的濃度。
17.電泳後完全不需要撬膠板。在壹個平盤裏放入水，將有膠的壹面在水中搖晃幾下。
二次膠很容易脫落，完全沒問題，而且很方便。
18.取樣時不要忘記離心樣品，因為樣品中的固體沈澱會影響電泳圖譜的分辨效果。
今天到此為止吧！如果想了解更多關於實驗的內容，歡迎私信樓主。最近正在整理細胞生物學實驗集，敬請期待。