實驗 1 紫外吸收法測定蛋白質含量
實驗目的
1．掌握紫外吸收法測定蛋白質含量的原理。
2.掌握蛋白質標準濃度曲線的繪制方法。
3.了解紫外吸收法的優缺點及適用範圍。
實驗原理
蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環上含有***共軛雙鍵，使蛋白質具有紫外吸收的性質，吸收峰在280nm處，吸光度（即光密度值）與蛋白質的含量成正比。
各種蛋白質中這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在 280nm 處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
樣品中的核酸對紫外光的吸收會影響蛋白質濃度的測定結果，但核酸的吸收峰在 260nm 附近。純蛋白質的 A280 與 A260 光吸收比約為 1.8，而純核酸的 A280 與 A260 光吸收比約為 0.5。
通過確定 A280 和 A260 的值，可以利用經驗公式或校準表大致計算出不純樣品的蛋白質濃度。
紫外吸收法測定蛋白質含量的優點：簡便、靈敏、快速，不破壞蛋白質也不消耗樣品，測定後仍可循環使用。低濃度鹽不幹擾測定，如硫酸銨和生化制備中常用的大多數緩沖液。
它特別適用於柱層析洗脫液的快速連續測定，在這種情況下只需測定蛋白質濃度的變化，而無需測定絕對值。
該方法的缺點是：測定蛋白質含量的準確性較差，幹擾物質較多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對於那些酪氨酸和色氨酸含量相差較大的蛋白質標準蛋白，存在壹定的誤差。因此，該方法適用於測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。
如果樣品中含有吸收紫外線的嘌呤、嘧啶和核酸，則會產生較大的幹擾。雖然核酸的幹擾可以通過計算校正表來減少，但測量結果仍會有壹定的誤差。
實驗儀器
紫外分光光度計、試管和試管架、微量移液器和槍頭。
藥物和試劑
1.濃度為 1 mg/ml 的標準蛋白質溶液。
2.待測蛋白質 A 溶液和 B 溶液（A 為純蛋白質；B 為含核酸的蛋白質）。
實驗方法
1.繪制蛋白質標準濃度曲線：標號試管，按表 3-1 向試管中依次加入各溶液，混勻。取直徑為 1 cm 的石英比色杯，用 "0 "管調零點，測定各試管在 280 nm 處的吸光值。以蛋白質濃度（mg/mL）為橫坐標，以光吸收值（A280）為縱坐標，繪制標準曲線。