如何保存菌種？

壹、菌種保存

(壹)、菌種保藏的目的

微生物在使用和傳代過程中容易汙染、變異甚至死亡，往往導致菌種衰退，並可能造成優良菌種的流失。菌種保藏的重要意義是盡可能保持其原有性狀和活力的穩定，保證菌種不死亡、不變異、不被汙染，以滿足方便研究、交流和使用的需要。

(2)、菌種保存的原則

無論采用什麽保存方法，首先要選擇典型菌株的優良純種菌株進行保存，最好保存其休眠體，如分生孢子、孢子等。其次，要根據微生物的生理生化特性，人為創造環境條件，使微生物長期處於代謝不活躍、生長繁殖受抑制的休眠狀態。這些人工環境主要是幹燥、低溫、缺氧。此外，避光、缺營養、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保鮮效果。

(3)、菌種保存的方法

1，斜坡低溫保存法

將菌種接種在合適的斜面培養基上，待菌種完全生長後，在4℃左右的冰箱中保存，然後每隔壹定時間(保存期)轉移到新的斜面培養基上，生長後繼續保存，如此連續。該方法廣泛應用於細菌、放線菌、酵母菌、黴菌等大多數微生物菌種的短期保存，以及不適合凍幹保存的菌種。放線菌、黴菌和有孢子的細菌壹般可保存6個月左右，無孢子的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如果用膠塞代替棉塞，然後用石蠟密封，存放在4℃的冰箱中，既能防止水分揮發和隔絕氧氣，又能防止棉塞被水分汙染。這種改進可以延長菌種的保存期。

這種方法的優點是簡單，易於推廣，成活率高，所以這種保存方法多用於科研生產中常用的菌種。其缺點是菌株仍有壹定的代謝活性，保存期短，傳代次數多，菌株易變異，易被汙染。

2.石蠟油密封方法

這種方法是在無菌條件下，將已滅菌並從水中蒸發的液體石蠟倒在成熟菌株的斜面(或半固體刺培養物)上，石蠟油層高於斜面頂部的lcm，使培養物與空氣隔絕。用固體石蠟密封後，垂直放入室溫或4℃的冰箱中。所用液體石蠟要求高品質、無毒、化學純度，其滅菌條件為:烘箱內150 ~ 170℃滅菌LH；或121℃高壓蒸汽滅菌60 ~ 80 min，然後在80℃烘箱中烘幹除去水分。

由於液體石蠟阻隔空氣，使細菌處於缺氧狀態，防止水分揮發，使培養物不會幹裂，因此保存期可達1 ~ 2年，或更長。該方法操作簡單，適用於保存黴菌、酵母菌、放線菌、需氧菌等。，而且黴菌和酵母菌的保存效果好，可保存數年，甚至長達10年。但對很多厭氧菌的保存效果較差，尤其是壹些能分解碳氫化合物的菌株。

3、砂管保存方法

這是長期保存菌種的常用方法，適用於放線菌、黴菌和產生孢子的細菌，但不適用於壹些對幹燥敏感的細菌，如奈瑟氏球菌、弧菌、假單胞菌和酵母菌。

制作方法如下:首先將砂和土分別洗凈、烘幹、過篩(壹般砂用60目篩，土用120目篩)，按(1 ~ 2): 1的砂土比混合均勻，分裝於小試管中，砂高約1cm，砂土比654438+0。在50℃下幹燥後，檢查並放在壹邊。還有的只是用沙子或土壤作為保存的載體。需要保存的菌種先在斜面培養基中充分培養，然後用無菌水制成108 ~ 1010 /ml的菌懸液或孢子懸液，滴入沙管中。放線菌和黴菌也可以直接刮下孢子與載體混合，然後放入烘幹機中約2 ~ 4小時，用火焰(或用石蠟)封住噴嘴，放入烘幹機中。

沙管法具有低溫、幹燥、隔氧、無營養等優點，因此保存期長、效果好、微生物移植方便、經濟簡單。比石蠟油密封法保存期長，約1 ~ 10年。中國科學院微生物研究所采用砂管保藏法保藏放線菌。

4、麩皮保存方法

麩皮保藏也叫曲保藏。即以麥麩為載體吸附接種的孢子，然後在低溫幹燥的條件下保存。制作方法是根據不同菌株對水分的不同需求，將麩皮和水按1: (0.8 ~ 1.5)的壹定比例混合，裝量為試管體積的2/5。濕熱滅菌後，冷卻，接種新鮮培養的菌種，在適宜的溫度下培養至孢子生長。將試管放入裝有氯化鈣等幹燥劑的幹燥器中，在室溫下幹燥幾天，然後移入低溫保存；試管幹燥後也可以用火焰封口後保存，效果更好。

該方法適用於產孢黴菌和部分放線菌，保存期在1年以上。由於其操作簡單、經濟，在工廠中被廣泛使用。中國科學院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲黴，如米曲黴、黑曲黴、泡盛曲黴等。，其保存期可達數年至數十年。

5、冷凍真空幹燥保存法

冷凍真空幹燥保藏法又稱凍幹保藏法，簡稱凍幹法。通常是在安瓿管中用保護劑制備待保存菌株的細胞懸液或孢子懸液，然後將含菌樣品低溫速凍，降低真空使水升華脫水幹燥，形成完全幹燥的固體菌塊。它會在真空條件下立即熔化並密封，從而形成無氧的真空環境。最後低溫放置，使微生物處於休眠狀態，可以長期保存。常用的保護劑有脫脂乳、血清、澱粉、葡聚糖等高分子物質。

由於該方法同時具備低溫、幹燥、缺氧條件，保存期長，壹般可達5 ~ 15年，成活率高，突變率低，是目前廣泛使用的理想保存方法。除了不產生孢子的絲狀真菌，這種方法不適用於大多數其他微生物，如病毒、細菌、放線菌、酵母和絲狀真菌。但這種方法操作復雜，技術要求高，需要凍幹機等設備。

需要保存的菌種時，可在無菌環境下打開安瓿管，向安瓿管內註入無菌培養基，將固體菌種溶解、搖勻、復水，然後接種在適合菌種生長的斜面上，在適宜的溫度下培養。

6、液氮冷凍保存法

液氮冷凍保存法簡稱液氮保存法或液氮法。甘油、二甲基亞碸等是壹種方法。用作保護劑，在液氮超低溫(-196℃)下保存。其主要原理是菌株細胞由常溫向低溫過渡，在溫度降至低溫前，細胞內的遊離水通過細胞膜滲出，避免遊離水在膜內凝結成冰晶而造成細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用這種方法時，將帶有菌絲的菌懸液或瓊脂塊以65438±0℃/min的速度從0℃冷卻到-35℃，然後保存在-65438±050℃~-65438±096℃的液氮冰箱中。如果降溫速度太快，由於細胞內的自由水無法滲出細胞外，就會形成冰晶，損害細胞。根據研究認為降溫速率控制在(1 ~ 10)℃/min，細胞死亡率低。隨著速度的增加，死亡率也相應增加。

甘油、二甲基亞碸、糊精、血清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、吐溫80等。常用作液氮冷凍保存的保護劑，但甘油(10% ~ 20%)是最常用的。不同的微生物要選擇不同的保護劑，然後通過實驗確定保護劑的濃度。原則上應控制在不足以引起微生物死亡的濃度。

這種方法簡單高效，保存期壹般可達15年以上。它是目前公認的最有效的菌種長期保存技術之壹。除少數對低溫傷害敏感的微生物外，該方法適用於各種微生物菌種的保存，甚至藻類、原生動物、支原體等都可以通過該方法有效保存。這種方法的另壹個很大的優點是它可以被各種培養物中的微生物保存，無論是孢子還是菌體，液體培養物還是固體培養物。其缺點是需要購買超低溫液氮設備，且液氮消耗量大，運行成本高。

使用該菌株時，從液氮罐中取出安瓿瓶，迅速放入35 ~ 40℃的溫水中使其凍結融化，無菌操作打開安瓿瓶，轉移至保存前使用的相同培養基斜面上進行培養。從液氮罐中取出安瓿時，速度要快，壹般不超過65438±0min，防止其他安瓿升溫，影響保存質量。並且取樣時壹定要戴專用手套，防止意外爆炸和凍傷。

(四)、目前國內外主要菌種保藏機構。

表8-1國內主要種質資源保存機構

單位縮寫單位名稱單位縮寫單位名稱

中國微生物菌種保藏管理委員會衛生部藥品生物制品檢定所

中國預防醫學科學院病毒研究所普通微生物菌種保藏中心

中國科學院CACC微生物研究所中國抗生素微生物菌種保藏中心

AS-IV中國科學院武漢病毒研究所，中國科學院IEM醫學生物研究所，中國醫學科學院

ACCC中國農業微生物菌種保藏中心SIA四川抗生素研究所。

中國農業科學院土壤肥料研究所IANP石家莊華北制藥廠抗生素研究所

CICC中國工業微生物菌種保藏中心CVCC中國獸醫微生物菌種保藏中心

IFFI中國食品發酵工業研究所農業部獸藥監察所