掌握致畸試驗的內容。致畸試驗（teratogenic test)：是鑒定動物致畸物的標準試驗法，下述的致畸試驗方案用以檢測藥物的致畸性，也能得到有關藥物致胚胎死亡及生長遲緩的資料。壹、實驗動物理想的致畸實驗動物對藥物的代謝過程應與人相近，胎盤結構亦相似，產仔多、孕期短、價廉、來源易及操作方便。在代謝功能與解剖結構方面，比較符合要求的動物是狗和猴；符合經濟實用要求的是兔、大鼠、小鼠及豚鼠。但小動物有不足之外，如兔自發畸形率較高，有時孕期長短不定（32-36天），大鼠對致畸作用有較大耐受性；小鼠對致畸反應介於兔與大鼠之間，‘自發畸形略高於大鼠；豚鼠胎盤結構與人相近，但孕期長（6O天左右）產仔少（4只）。常用大鼠，小鼠和兔。特別是大鼠，因為大鼠自發畸形率低，胎鼠大小也適於檢查。雌性動物宜用成年末懷過孕的動物。動物選擇要求對藥物敏感性高，而自發畸變形率低，至少采用兩種動物，壹種嚙齒類，另壹種要求非嚙齒類。二、動物受孕及檢查方法以大鼠為例，選用鼠齡三個月以上，體重200-250g雌鼠，飼養數天後作陰道分泌物塗片檢查，以判斷是否處於動情期。如塗片見有較多白色分泌物，鏡檢發現有較多核上皮細胞，提示雌鼠處於動情前期。大鼠性周期壹般為4-5天，動情前期向動情期移行多在夜間。處於動情前期的鼠按2:1或3:2比例與同齡雄鼠同籠過夜，次日檢查是否受孕。檢查受孕方法有兩種。壹是檢查陰栓，陰栓是雄鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結而成的白色塊狀物，形似米粒，大鼠的陰栓很易脫落，次日可於鼠籠下的糖瓷盤內發現，小鼠的陰栓不易脫落，位置較深時用鑷子撐開陰道口方能看清。二是陰道塗片檢查精子，可用棉簽插人陰道轉動數次後拔出，塗抹在滴有生理鹽水的玻片上，在低倍鏡下查找精子。查到陰栓或精子即提示懷孕，檢出日為孕期的“0天”，次為第1天，以此推算孕齡。受孕率在春、秋季較高（可達70％以上）夏、冬季較低(50%），所以也可采用人工控制溫度（23℃左右）及光線，讓雌雄動物每天同籠6小時後作陰道塗片，以提高受孕率並便於在白夭工作。三、劑量分組，給藥方式及時間受試動物分為4-5組，其中3個劑量組（高、中、低），其余兩組為陽性對照和陰性對照組。高劑量組應有母體毒性反應，或為最大給藥量。攝食量的減少，體重增長緩慢或下降，陰道出血，流血等均是毒性反應的表現；低劑量組應為母體和胚胎毒性反應劑量。壹般為臨床擬用劑量的某些倍量。中間劑量應在高、低劑量組之間，劑量組間距應為幾何級數，並能顯示微小的毒性差別。也可用LD50的1/3-1/5為高劑量組，低劑量組用1/30-1/100LD50，按等比差在高、低劑量組間插進中間劑量，以期得出最小致畸劑量或最大無作用劑量。如已掌握或能估計人類實際接觸量，也可以人實際接觸量（或估計量）為低劑量組，並以其數倍（如10倍）為高劑量組。陰性對照組為溶劑（賦形劑）對照。陽性對照可用乙酞水楊酸(大鼠250mg/kg,小鼠150mg/kg),維生素A(濃魚肝油5m1/kg)。家兔可用6-氨基煙酰胺（2.5mg/kg）。已經進行過致畸試驗，並確知所用的試驗動物對致畸物有陽性結果的實驗室可略去陽性對照，每組受孕動物數大鼠和小鼠15-20只，兔8-10只，狗和猴3-4只。染毒途徑應根據受試物的性質及人類可能的接觸方式而定，壹般多用灌胃和腹腔註射。染毒時間應選擇胚胎對致畸物的易感期（器官形成期）。大、小鼠和兔進行致畸試驗的日程安排見。每只試驗動物在試驗期間都應有準確記錄受精日期，給予受試物日期和劑量，給藥後動物的體重應每隔3-4天稱壹次（0,3,7,10,13、16,20），並根據體重調整給藥劑量，，另壹方面也可對受試物動物受精後懷孕與否及受試物對胚胎發育有無影響作出初步估計，如懷孕胚胎發育正常，則受試動物的體重可明顯地持續增長；若胚胎中毒死亡或流產，母體體重則停止增長以至下降。四、觀察⑴ 對母體的觀察：每天檢查有無中毒癥狀，對有流產或早產征兆者（如見陰道出血），及時處死檢查。⑵對胎仔的觀察：於分娩前1-2日處死受孕動物，以防止自然分娩後母鼠吞食畸形仔鼠。剖腹取出子宮和卵巢，稱重辨認子宮內的活胎、死胎及吸收數，並從左側子宮角頂端開始直到右側子宮頂端，按順序編號記錄：然後檢查和記錄黃體數。活胎：完整成形，肉紅色，看自然運動，對機械刺激有運動反應；胎盤紅色，較大。晚死胎：完整成形，灰紅色，無自然運動，對機械刺激無反應；胎盤灰紅色，較小。早死胎：紫褐色，未完整成形，無自然運動，胎盤暗紫。吸收胎：暗紫或淺色點塊，不能辨認胚胎和胎盤。黃體：在卵巢表面呈黃色魚子狀突起，提示孕鼠的排卵數。活胎的外觀畸形並記錄的類型、部位及程度。將每只母鼠的2/3活胎剝去皮膚和內臟，經茜素紅染色及脫水透明後，檢查骨骼畸形；余1/3活胎浸人鮑音氏(Bouin)固定液，供檢查內臟畸形。常見的外觀、骨骼和內臟見表18-6、表18-7、表18-8。由於目前沒有充分證據表明骨骼對致畸物比內臟更敏感，因此，有人主張將來自兩個子宮角的胎鼠隨機分配到骨骼畸形檢查中。現將胎仔的外部檢查及骨骼和內臟畸形檢查的具體方法敘述如下：⑴ 胎仔外部檢查：將處死（或深度麻醉）的試驗動物剖腹暴露子宮，進行下列的檢查和記錄。①確定懷孕情況、順序編號依次鑒別檢查活胎數，早期死胎數，晚期死胎數和吸收胎數。②剪開子宮，按編號順序，對胎仔逐壹檢查記錄性別、體重、身長、尾長和全窩胎盤總量。③對活胎仔由頭部、軀幹、四肢、尾部進行外觀檢查，各部位常見的畸形見表18-6。(2)胎仔的骨骼檢查：胎仔的骨骼檢查是致畸試驗壹項重要觀察內容，壹般是將每窩胎仔的1/2或2/3數量留作此項檢查。其具體方法如下：①將留作骨骼檢查的胎仔放入75%-90%的乙醉溶液中進行固定，時間2-5天。②固定好的胎仔置於1%的氫氧化鉀溶液中3-10天，直至肌肉透明可見骨骼為止。在此期間依據情況可更換1%,氫氧化鉀溶液數次，每次更換溶液時將胎仔脫落的皮膚洗去。③經1％氫氧化鉀溶液處理後的胎仔，用茜素紅進行染色直至骨骼染成桃紅色或紫色為止，壹般需2-5天，必要時中間須更換新染色液數次。茜素紅染色液的配制：將茜素紅加人下面混合液中至飽和為止。冰醋酸 5m1純甘油 10ml1％水合氯醛 60ml使用時取上述茜素紅飽和溶液lml，加1%氫氧化鉀溶液至1000ml混合配成應用液。④經染色後的胎仔置於以下透明液中1-2天。若透明不夠滿意時，可適當延長在透明液中的時間。透明液I：甘油20分，2 %氫氧化鉀溶液3分，蒸餾水77分。透明液II：甘油50分，2%氫氧化鉀溶液3分，蒸餾水47分。透明液III：甘油75分，蒸餾水25分。經上述處理的胎仔骨骼標本，可在肉眼或放大鏡，解剖顯微鏡下觀察檢查。註意檢查各骨骼的狀態，大小，數量有無異常及骨化程度。(3)胎仔的內臟檢查：經外觀檢查後的胎仔隨機法將胎仔數1/2或1/3置於鮑音(Bouin）氏液中 固定1-2周後，即可用徒手切片觀察方法進行檢查，其具體方法如下：頭部器官的檢查壹通過以下切面來進行觀察檢查。①戴橡皮手套取出固定好的胎仔標本，在自來水下洗去固定液，用單面刀徒手沿口經耳作壹水平切面，這壹切面將口腔上下愕分開，主要檢查有無愕裂，舌缺或分叉。②把上述切面切下的顱頂部，沿眼球前沿垂直作額狀切面，這壹切面著重檢查鼻道有無畸形，如鼻道擴大、單鼻道等。③沿著眼球正中垂直作第二額狀切面，檢查眼球有無畸形，如少眼，小眼，無眼。檢查有無腦積水，有無腦室擴大。④沿眼球後緣垂直作第三個額切面，檢查有無腦水腫積水，有無腦室擴大。胸腔、腹腔和盆腔檢查沿胸、腹壁中線和肋下緣水平線作“十”字切開胸腹，暴露胸腔、腹腔及盆腔內的器官，然後逐壹檢查各主要臟器的位置、數目、大小勻稱性及形狀等有無異常。五、結果評定主要計算畸胎總數和畸形總數。在計算畸胎總數時，每壹活胎仔出現壹種或壹種以上畸形，均作為壹個畸胎。計算畸形總數時，在同壹活胎仔出現壹種畸形，作為壹個畸形計算，如出現兩種或兩個畸形，即作為兩個畸形計算，並依此類推。計算畸胎總數和畸形總數的同時，必須考慮其有無劑量壹效應關系，更重要的是按下列指標與對照組進行比較：1．對各組母動物需統計如下指標⑴ 交配成功動物及交配率。⑵ 死亡動物數及死亡率。⑶ 剖檢母動物的平均體重及孕期體重增長值或母體增重。母體增重（g）＝處死時母體體重-妊娠第6日體重-處死時子宮連胎重⑷ 母體畸胎出現率，主要根據出現畸胎的母體在妊娠母體總數中所占的百分率。計算出現畸形母體數時，同壹母體不論出現多少畸形胎仔或多種畸形，壹律按壹個出現畸形胎仔的母體計算。2．對各組胎仔需統計如下指標⑴ 平均活胎數及活胎率⑵ 吸收胎數和吸收胎率⑶ 死胎數和死胎率。⑷ 外觀畸形率、骨骼畸形率、內臟畸形率3．實驗組及對照組的數據進行統計學分析不同指標用不同的顯著性檢驗方法處理。平均體重、平均黃體數、平均著床數、平均活胎數、平均活胎體重用t檢驗：妊娠率、交配率、受孕率、活胎率、用χ2檢驗；胎吸收率、死胎率、畸胎率用非參數統計。可能時計算劑量壹效應關系。根據上述指標計算後，最後評定結果，確定此種受試物是否具有致畸作用，尚要註意下列間題：(1)致畸作用具有劑量與效應關系，所以，對任何畸形的出現是否具有劑量壹效應關系應該充分考慮‘更重要的是必須經過統計學處理，肯定試驗組出現致畸胎的母體顯著高於對照組，並且試驗組動物活胎仔出現的畸形率應顯著高於對照組，才可考慮其致畸作用。(2)每個實驗室應掌握所用試驗動物長期以來的自然畸形發生情況，包括自然出現的畸形類型和頻率。試驗組動物出現的畸形，如長期以來在對照組動物未曾出現過，則對受試物致畸作用，更應認真對待；反之，則應慎重做出結論。(3)生物體常有變異現象，變異是群體中個體間的差異。特別是同壹物種內壹個體與另壹些個體的差異。變異為基因所控制，具有適應和進化的意義，與外來化合物幹擾胚胎正常生長發育所引起的畸形完全不同，有人認為肋骨椎骨數目比正常多壹個或少壹個等現象皆屬於變異，不能做為致畸。但變異出現率壹般較低，也不呈現劑量與效應關系，借此可將兩者加以區別。(4)致畸作用中存在種屬差異，而且同種動物的品系間亦有差異。因此，在壹種動物出現致畸作用後，最好在另壹種動物再進行試驗或至少在同種動物再重復進行試驗。如結果壹致，才可以認為對動物確有致畸作用。⑸ 由於致畸作用存在種屬差異，所以任何外來化合物對動物具有致畸作用，不壹定對人類致畸。壹方面應進壹步進行人群流行病學調查，以確定其在人體的致畸作用；另壹方面應認識致畸作用是外來化合物的毒性表現的壹種。凡是對動物具有致畸作用的化合物，也應看作對人體致畸的可能，故應采取各種措施，使人類盡量減少與其接觸，這壹問題涉及動物致畸試驗結果推論到人的問題。動物試驗結果推論到人的間題，目前在毒理學中極為重視面研究也極為活躍。雖然有人提出許多方法或途徑，但迄今為止，還沒有建立壹個簡單的方法，將動物試驗結果推算到人。致畸作用也是如此，絕對不能簡單地將小鼠，大鼠或其它動物的實驗結果直接應用於人。現參考歐洲經濟***同體和經濟合作開發組織所建議的致畸物分級標準，且加以綜合。註意其在實際工作中僅能做為參考，必須結合實際情況，分析思考，靈活運用。(6)將壹種外來化合物對人類的致畸作用進行最後評定，決定取舍時，應該特別註意人類實際接觸劑量的問題。有許多藥物達到壹定劑量，都可以呈現致畸作用，例如作為藥物的水楊酸制劑，可引起畸胎，反應停能使很多動物致畸。甚至有些人體需要的營養素，例如維生素A，在壹定劑量上，也具有致畸作用，並常常作為致畸試驗中的陽性對照物。所以，任何外來化合物以壹定劑量，在壹定的胚胎發育階段，與壹定的動物種屬接觸，都可幹擾胚胎的發育，並可能造成畸形。對壹種外來化合物是否具有致畸作用，進行最後評定，並據此而考慮是否允許使用，應該充分考慮可能與人體接觸的實際劑量和接觸的方式與途徑，尤以劑量最為重要。
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致畸試驗
第七節 致畸試驗
掌握致畸試驗的內容。致畸試驗（teratogenic test)：是鑒定動物致畸物的標準試驗法，下述的致畸試驗方案用