丙二醛提取原理

植物組織中的丙二醛(MDA)在酸性條件下加熱能與硫代巴比妥酸(TBA)反應，反應產物為粉紅色的3，5，5-三甲基惡唑2，4-二酮(Trimet—nine)。該物質在波長539納米處有壹吸收峰。由於硫代巴比妥酸也能與其他物質反應，在此波長處有吸收，為了消除硫代巴比妥酸與其他物質反應的影響，在測定丙二醛含量的同時，測定600nm處的吸光度，利用539nm處的吸光度與600nm處的吸光度之差計算丙二醛含量。

植物組織中丙二醛含量的測定

植物葉片在衰老過程中會發生壹系列的生理生化變化，如核酸和蛋白質含量下降、葉綠素降解、光合作用降低、內源激素失衡等。這些指標在壹定程度上反映了衰老過程的變化。最近大量研究表明，逆境應激或衰老過程中，細胞內活性氧代謝平衡被破壞，有利於活性氧的積累。活性氧積累的危害之壹是引發或加劇膜脂過氧化，導致細胞膜系統的損傷，嚴重時甚至導致植物細胞死亡。活性氧包括含氧自由基。自由基是具有不成對價電子的原子或自由基。生物體內產生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羥基自由基(OH)、過氧自由基(ROO)、烷氧基自由基(RO)、過氧化氫(H2O2)、單線態氧(O21)等。植物對活性氧有酶和非酶防禦系統。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(ASA—POD)是酶促防禦系統中重要的保護酶，而抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)是非酶促防禦系統中重要的抗氧化劑。

丙二醛是膜脂過氧化的產物之壹，其產生也可加重膜損傷。因此，丙二醛的多少可以代表膜脂過氧化的程度，也可以間接反映植物組織的抗氧化能力。因此，丙二醛含量是植物衰老生理和抗性生理研究中常用的指標。

[材料、儀器、藥物]

1.材料:將綠葉和黃葉四種菠菜樣品進行高溫處理，並在室溫下進行比較。

2.儀器:(1)分光光度計；(2)離心機；(3)水浴鍋:(4)平衡；(5)砂漿；(6)剪刀；(7) 5ml刻度離心管；(9)校準試管(10毫升)；(10)鑷子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml)；(12)冰箱。

3.藥物:(1) 0.05mol/L pH7.8/L磷酸鈉緩沖液pH 7.8(2)石英砂；(3) 5%三氯乙酸溶液:稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水溶解，然後定容至100ml；；(4) 0.5%硫代巴比妥酸溶液:稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml，即為0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液。

[方法]

1.丙二醛的提取:取0.5g樣品，加入2ml預冷的pH 7.8的0.05mol/L磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在冰浴研缽中研磨成勻漿，轉移至5ml刻度離心試管中，用緩沖液洗滌研缽，然後轉移至離心管中。最後用緩沖液將體積固定為5ml。以4500 rpm的速度離心10/分鐘。上清液是丙二醛提取物。

2.丙二醛含量測定:吸取2 ml提取液於帶刻度的試管中，加入3ml 0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液，沸水浴中加熱65438±00min，迅速冷卻。以4500 rpm的速度離心10/分鐘。取上清液，在波長532和600nm處，以蒸餾水為空白調節透光率至100%，測定吸光度。

3.結果的計算:

(A532—A600) ×V1×V

1.55×10-1×寬×V2

丙二醛含量(納摩爾/克)=

其中:a為吸光度；V1為反應溶液總量(5m 1)；v為總提取物(5ml)；V2是反應溶液中提取物的量(2ml)；w是植物樣品的重量(0.5g)；1.55×10-1為丙二醛的微摩爾吸收系數(含1在1升溶液中？摩爾丙二醛的吸光度)。

4.註意事項:

(1) 0.1 ~ 0.5%三氯乙酸適用於MDA—TBA反應。如果濃度高於此，則反應溶液的非特異性吸收更高。

(2)沸水浴中MDA-TBA顯色反應的加熱時間應控制在10~15min之間。時間過短或過長都會導致532nm處的光吸收值降低；

(3)如果用MDA作為植物衰老的指標，首先應檢查受試材料的提取物是否能與TBA反應，在532nm處形成吸收峰。否則只測532和600nm處的A值，計算結果與實際情況不符，所以測得的高A值是假象。

(4)在糖類的幹擾下(如深度老化)，吸光度的增加不再是由於脂質過氧化產物MDA含量的增加，而是由於水溶性碳水化合物的增加，從而改變了提取液的組成。MDA含量不能再用532nm和600nm處的A值來計算，而565，438+00，532和560nm處的A值可以用A532-(。