DNA(循環腫瘤DNA (ctDNA)是循環無細胞DNA (cfDNA)的壹部分，來源於腫瘤細胞雕亡、壞死或分泌產生的DNA片段。健康人大部分cfDNA的長度為70~200 bp，但腫瘤患者的ctDNA長度可能為200 bp，甚至超過1000 bp。CtDNA含有與其腫瘤DNA相同的遺傳缺陷，如點突變、重排、擴增、微衛星改變、表觀遺傳修飾等。當腫瘤DNA進入血液時，也可以在血漿和血清中檢測到這些基因缺陷模式。
甲基化是DNA的重要修飾，是指在DNA甲基轉移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基基團轉移到特定堿基上的過程。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸的C上，產生5-甲基胞嘧啶(5mC)。人類基因組中60%~90%的(CpG)是甲基化的，未甲基化的CpG成簇形成CpG島，主要位於基因的啟動子和外顯子區域，長度為300~3 000 bp。啟動子區域附近或內部的異常甲基化通常抑制轉錄並沈默相關基因的表達。在腫瘤中，抑癌基因和DNA修復基因啟動子區域的異常高甲基化使抑癌基因沈默，修復基因失活，從而失去對腫瘤發生的抑制作用，這也是目前腫瘤甲基化研究的主要方向。與其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化是最早的表觀修飾方式之壹，其異常甲基化模式在不同腫瘤組織中具有高度特異性。特征性甲基化指紋可用於癌癥的早期診斷和分期、療效評價、復發監測和預後判斷。
在ctDNA甲基化檢測在癌癥診斷和治療中的應用中，基於血液樣本可以在壹定程度上克服實體腫瘤組織樣本的局限性。如(1)ctDNA在血液中半衰期短，能實時反映腫瘤的動態變化；(2)可以克服腫瘤組織取樣的異質性；(3)重復活檢可以追蹤腫瘤的克隆進化；(4)可以識別轉移性腫瘤。因此，在過去的30年裏，DNA甲基化被認為是壹種很有前途的檢測癌癥的生物標誌物[1]。
壹、ctDNA甲基化檢測的方法和研究思路。
1.常見的檢測方法和技術難點:
目前，ctDNA甲基化標誌物的研究思路已經比較清晰。首先通過芯片或二代測序對腫瘤組織和正常組織進行全基因組甲基化信號掃描，尋找腫瘤特異性甲基化標記位點。然後對這些性價比較高的位點進行ctDNA靶向測序，驗證標記的性能。雖然研究思路清晰，但甲基化檢測技術的諸多局限性壹直困擾著研究者。壹方面，血液中的ctDNA含量很低，某些特定類型的腫瘤或晚期腫瘤可能達到20 ng/ml。最大的技術挑戰是從含有不同數量cfDNA的血液樣本中識別出非常少量的ctDNA。另壹方面，目前的甲基化檢測技術基本上是基於亞硫酸氫鹽(BS)將DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)脫氨基並轉化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(mC)保持不變。目前基於BS的甲基化檢測技術主要有PCR擴增、測序和基於雜交的捕獲技術[2]，其中擴增技術應用較為廣泛。經BS處理後，未甲基化的C變成U，經PCR擴增後，U與T配對，因此擴增的DNA變得富含A和T(AT-rich)，與原來甲基化的C堿基不同。但發現甲基化的DNA(GC含量高)容易出現擴增偏好，在文庫中富集。因此，需要高效地捕獲BS DNA片段，同時，確保甲基化信號在擴增過程中被均勻地擴增，而沒有混疊。
2.近年來研究思路的突破方向:
以往的研究大多集中在單基因啟動子區域的甲基化，發現多基因聯合檢測可以進壹步提高DNA甲基化特征的特異性和敏感性。隨著生物信息學技術的快速發展，甲基化檢測已經從單基因逐步擴展到多基因組合和全基因組水平。2017發表在《自然遺傳學》雜誌上的壹篇文章定義了147 888個緊密偶聯的CpG基因座，稱之為CpG甲基化單倍型塊(MHB)。經過對61全基因組BS測序數據集的分析，並利用101 BS測序數據集和637甲基化芯片數據集進行驗證，確認在約170 bp的cfDNA中更容易檢測到大小為95 bp且含有≥3個CpG位點的MHB。最後，對59例肺癌或結直腸癌患者的腫瘤組織和循環cfDNA進行MHB評估，發現借助腫瘤特異性MHB模式可以進壹步提高甲基化指紋的準確性，並從痕量檢測中找到甲基化的組織來源[3]。2017年，通過機器學習分析全基因甲基化譜後，發現了四種常見腫瘤的特異性甲基化分子標記，包括肺癌19、結直腸癌6、乳腺癌15和肝癌3。這些標記可以區分腫瘤和正常組織，準確率超過95%。進壹步對30例結直腸癌肝轉移和34例肺轉移的無監督分層聚類分析表明，高度組織特異性甲基化特征可以正確診斷腫瘤起源，正確診斷率分別高達96.7%和94.1%[4]。與上述研究方法類似，研究人員在肝癌大樣本研究中篩選了10個甲基化標記，建立了血肝癌ctDNA甲基化診斷模型。已經證明，該模型可以區分正常人、肝病背景(肝炎、肝硬化等。)和肝癌患者，且與肝癌的腫瘤負荷、治療反應和臨床分期有較好的相關性，再次證實了ctDNA甲基化檢測的臨床優勢[5]。
二、ctDNA甲基化檢測的臨床應用
1.CT DNA反映了基因啟動子區高甲基化的壹致特征，可用於腫瘤診斷；
與DNA突變相比，基因特異性啟動子區域的異常甲基化可能是癌癥的壹致特征。比如前列腺癌中谷胱甘肽S-轉移酶P1(谷胱甘肽S-轉移酶P1，GSTP1)基因90%甲基化，乳腺癌中96%為stratifin。SFN)基因甲基化[7]，同源盒蛋白A9 (HOXA9)基因和鋸齒狀同源盒蛋白1(鑲嵌同源盒1，EN1)基因分別在95%和80%的卵巢腫瘤中甲基化[8]。在73%的肝細胞癌中，細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A (CDKN2A)的基因被甲基化[9]。高度壹致的甲基化特征使得ctDNA甲基化被廣泛應用於腫瘤診斷。用於診斷的商業產品也已經投放市場。例如，基於糞便的結直腸癌篩查試驗結合了N-myc下遊調節基因4 (NDRG4)和3(骨形態發生蛋白3 (BMP3)基因的甲基化改變和突變檢測，於2014年獲得美國FDA批準，是首次DNA甲基化檢測。此外，Epi proColon對Septin 9基因甲基化的檢測和分析用於全結直腸癌篩查[11]，Epi proLung對短同源盒蛋白2 (SHOX2)基因甲基化的檢測和分析於2015年7月獲得中國FDA批準[12]。
2.2.ctDNA甲基化的檢測反映了腫瘤負荷的變化，可用於監測治療反應:
癌癥特異性ctDNA甲基化模式可用於定量腫瘤DNA並提供關於腫瘤負荷水平的信息。有研究表明，細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A基因的中位甲基化指數(甲基化循環CDKN2A/總循環CDKN2A)從術前的35%下降到術後的3.5%[13]。44%~68%的食管癌患者檢測到APC基因甲基化[14]，食管癌患者術後血液中APC基因甲基化水平與術後腫瘤殘留顯著相關[15]。
ctDNA甲基化除了反映術後腫瘤負荷的降低，還可以反映腫瘤對化療藥物的反應。目前，大多數轉移性惡性腫瘤至少需要3個周期的化療，才能根據常規影像學和生物標誌物進行評估。這種延遲使許多患者暴露於不必要的藥物毒性，並延遲了其他潛在有效的治療機會。早期檢測對治療藥物的反應對於改善腫瘤患者的預後是至關重要的。目前常規監測主要通過檢測血液蛋白生物標誌物來進行。ctDNA甲基化檢測反映腫瘤負荷變化的特點使其成為監測治療反應的新方法。壹些研究報道了使用ctDNA甲基化定量來監測化療期間多個時間點的腫瘤動力學，例如使用血漿ctDNA甲基化GSTP1來追蹤前列腺癌患者對化療的反應。在接受多西他賽或米托蒽醌的35名探索性患者隊列中，首次化療後2至38個月內(中位數15個月)血漿甲基化GSTP1水平升高，然後前列腺特異性抗原(PSA)水平升高。 表明血漿甲基化GSTP1可能是比PSA更好的總生存期預測因子[ Fackler et al. [17]最終選擇了10基因甲基化標記物，通過全基因組甲基化芯片篩選和TCGA數據縮小區分乳腺癌和健康對照，然後追蹤了29名接受多西他賽、伊馬替尼或卡培他濱治療的乳腺癌患者血清中上述標記物的甲基化水平，發現上述組合的甲基化水平在1~2周後下降 持續的隨訪觀察表明，在臨床疾病進展之前，可以檢測到ctDNA的甲基化水平。此外，還發現血清Ras相關結構域家族1A (RAS關聯結構域家族1A，RASSF1A)和視黃酸受體β 2 (RARB2)基因的甲基化水平預示著肺癌的治療反應[18]。
雖然上述研究將ctDNA甲基化的降低與腫瘤體積的減小相關聯，從而評估化療的敏感性，但考慮到ctDNA在血液中的半衰期僅為2 h，因此可以為腫瘤狀態的變化提供非常快速的測量。2015王等[19]采用了不同的思路，用甲基化ctDNA的增加來評價化療誘導腫瘤細胞死亡的程度。結果顯示，RASSF1A或APC1在24小時內甲基化水平的升高與完全/部分化療反應有關，而這兩個標記物在治療後保持不變，與腫瘤的穩定性/進展有關。這些不同方向的ctDNA甲基化變化可以用化療誘導的細胞死亡引起的ctDNA水平的最初激增來解釋。與上升時間相比，化療後ctDNA甲基化下降時間範圍為1周~ 1年。這些波動強調了詳細描述ctDNA動力學對化療反應的重要性。
3.3.ctDNA甲基化的檢測可反映腫瘤的預後、侵襲和復發情況；
甲基化可以通過沈默調節細胞生長和轉移潛能的基因來促進腫瘤進展，也可以反映腫瘤亞型，因此與腫瘤預後有關，許多研究被用於指示腫瘤侵襲和復發的可能性。在ctDNA甲基化和腫瘤預後的研究中，所選基因在腫瘤相關過程中具有已知的功能，如細胞增殖和雕亡，例如，X連鎖雕亡抑制蛋白相關因子1 (X連鎖雕亡抑制蛋白相關因子1，XAF1的甲基化)基因與生存率下降有關。甲基化XAF1患者和非甲基化XAF1患者術後中位無病生存期分別為23.4個月和39.6個月[20]。性別決定區Y基因盒17 (SOX17)通過調節WNT信號轉導通路發揮抗腫瘤作用，其表達抑制可促進腫瘤發生。兩組研究報道血液中SOX17甲基化與食管癌和胃癌預後不良有關。在40例食管癌患者的隊列中，包括SOX17在內的8個基因啟動子和外顯子1中的9個CpG甲基化探針用於預測預後。在多變量分析中發現SOX17是壹個獨立的預後因素[21]。在另壹組73名胃癌患者中，血清SOX17甲基化與腫瘤分化和總生存期相關[22]。RARB2是壹種視黃酸受體，通常起抗腫瘤作用。其甲基化已被證明與大腸癌、乳腺癌、肺癌預後不良有關[18]。在胃癌中，RUNT相關轉錄因子3 (RUNX3)基因的術前血清甲基化水平在晚期高於早期，復發病例的RUNX3的術前血清甲基化水平明顯高於非復發病例，可能是因為ctDNA的甲基化水平反映了腫瘤的負荷。此外，評估血清RUNX3甲基化和CEA可以提高結直腸癌的診斷[23]。
綜上所述，ctDNA甲基化可以克服現有腫瘤標誌物特異性差、假陽性率高的缺點，在臨床應用中顯示出廣闊的前景。但也要意識到，ctDNA甲基化檢測真正進入臨床還有很長的路要走。主要應註意以下幾點:
(1)由於臨床試驗中抗腫瘤療效的評價需要長期隨訪收集完整的治療信息和預後信息，目前在臨床上有壹定難度。在ctDNA甲基化的檢測中，要註意樣本采集的時間點，比如治療前後的對比來評估療效，甚至可以在整個治療過程的多個時間點采集樣本來監測病程。
(2)ctDNA在血液中半衰期短，應考慮其甲基化動力學。
(3)技術進步使得檢測數萬個CpG位點成為可能，但全基因組ctDNA甲基化檢測技術對生物信息學提出了更高的要求。
(4)4)ctDNA甲基化標誌物的診斷效力仍需與其他腫瘤循環生物標誌物進行比較。未來，ctDNA甲基化檢測可用於癌癥的個體化實時診斷和治療，包括癌癥篩查、診斷、療效監測和預後判斷。