2019年12月05日國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心發布了 《腫瘤相關突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用註冊技術審查指導原則》 ，該原則為NGS panel 的註冊和評審提供了指導意見，其中壹些內容是需要重點學習，以下為學習記錄。
基於NGS測序原理的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）檢測可能包括以下步驟： 樣本收集、處理和保存、核酸提取及處理、文庫制備、測序和堿基識別、序列比對、變異識別和過濾、變異註釋和解讀以及檢測報告的生成 。同時，某些產品還可能會包括軟件部分，但上述相關步驟並不壹定被全部包括，應根據產品的具體設計流程來進行判斷。對於每個檢測步驟，申請人需要結合產品設計和臨床意義來建立特定的可接受的質量評價指標和合格判斷標準。此外，為滿足產品特定預期用途，申請人需通過科學和適當的檢測性能研究來確定適用的試劑、消耗品、儀器和軟件。 基於上述考慮因素，NGS檢測產品的設計和工作流程中的任何差異均可能導致結果的不同，因此申請人需要清楚地描述相關檢測性能指標。分析性能評價的初衷在於提出產品性能有效性、安全性相關問題的假設，然後通過研究進行確認。
理想狀態下，陽性參考品應當包括對所申報產品每個基因型的質控樣本。但考慮到基於NGS技術的可檢測基因數量較多，申請人應結合產品預期用途、臨床意義及基因類型等因素進行針對性和代表性的設計。
對於有明確腫瘤伴隨診斷相關的基因，應考慮該類基因參考品設置的合理性和完整性， 需包括伴隨診斷相關的全部熱點基因，建議采用臨床樣本或細胞系提取的核酸儲備液作為原料 。
對於具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，應考慮代表性問題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。
如檢測編碼區較大且存在非熱點區域設計（如大於1M），建議在陽性參考品中考慮對檢測整體區域的靈敏度驗證（主要關註SNV等），如混合的永生化正常人白細胞DNA儲存液等。
不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度範圍設置應具有代表性並提供這樣設定的依據 。陽性參考品的突變形式及拷貝數需采用有效方法進行確認，並明確接受標準。申請人在設計陽性參考品時可壹並考慮檢測限參考品的設置及確認方式，並提供相關的依據。
模擬病人樣本的目標核酸序列，並用於質控整個檢測過程，包括核酸提取（如適用）、文庫構建、測序和數據分析。目前陽性質控檢測和分析過程應與臨床樣本方式壹致。
陰性參考品及陰性質控品建議為正常臨床樣本的混合物或細胞系，應明確不含有目標區域腫瘤突變基因。
精密度參考品設置要求可參考陽性/陰性參考品。
申請人應根據申報產品特點設置NTC質控品及檢測接受標準，監測檢測過程中是否存在汙染。
分析性能驗證包括通過壹組預定義性能評價方式，以證明性能是否足以滿足其預期用途並符合預定義的性能標準。通常涉及是否符合統計學評價要求，或檢測是否存在與患者的疾病相關的變異等。
準確性包括對比檢測值與被檢測值之間壹致性。對於基於NGS測序原理的檢測，通過與適當的對比方法比較，如核酸測序或其他經過驗證的方法，評估申報產品準確性能。
根據待評價方法和對比方法對所有變異的檢測結果分別計算 陽性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）、陰性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）、陽性預測值（Positive Predictive Value，PPV）、陰性預測值（Negative predictive value，NPV） 。通過檢測評估的每種類型的變異，如單核苷酸多態性（Single Nucleotide Variant，SNV）、插入、結構變異，和測序區域範圍（如高度同源、高度多態或其他困難的區域），分別計算PPA、NPA等。
表1註： PPA通過將A（真陽性結果數）除以（A+C）、NPA通過將D（真陰性結果數）除以（B+D） 。這些計算不應包含任何無應答或無效應答，無應答或無效應答結果應被單獨列出（見表2）。根據適用情況計算每種變體類型以及臨床相關變異PPA、NPA等。
明確可接受的最低檢測限（Limit of Detection，LoD），並明確無效應答或無應答檢測結果的可接受標準。為預期用途中包含的每種變異類型建立LoD。如果檢測人工混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測限。
試劑LoD的研究中應在常規臨床實驗室條件和確定的樣本類型下進行。 通常，LoD值采用分析物最低濃度計算得出，在此濃度下，可從相應檢測重復中獲得至少95%的陽性檢出和可接受水平的無應答或無效應答 。當不同的變異類型可能具有不同的LoD時，需要計算不同的序列被測區域範圍中的每個變異類型的LoD。NGS檢測方法可以同時檢測多種類型突變基因，因此靈敏度的設置應根據不同突變基因類型及判讀方式進行驗證。
應確認不會對報告區域的質量分數或覆蓋率產生負面影響。應包含具有代表性的基因區域、變異類型和序列背景進行驗證研究。設置空白檢測限檢測標準，設定評價方案及方法。
分析特異性是評估產品僅可檢測到預期待測變異的能力。根據預期用途和產品設計，壹些潛在的內源性或外源性物質幹擾和交叉反應或交叉汙染可能會對產品檢測性能產生影響。
交叉反應（如同源區域、假基因和其他類型的交叉反應序列）可能導致錯誤檢測，從而產生假陽性結果。患者標本的交叉汙染可能將其他不正常的序列引入到檢測中，從而導致假陽性或假陰性結果。因此，應選擇產品預期用途所覆蓋樣本或樣本類型以及DNA提取方法中相關的幹擾物質開展研究。同時，應對已知交叉反應的等位基因和同源區域進行評估。
精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數，不同儀器等），並考慮檢測中主要的變異來源 。申請人應評估變異和野生型基因的精密度，其中應分別報告不同檢測區域和變異類型的檢測值。申請人應使用客觀證據和有效的統計方法來驗證這些指標設定標準。
對可能導致檢測結果多樣性的主要因素進行評價，包括但不限於檢測多個樣本、不同檢測批間、不同適用機型、試劑批次、檢測天數和操作員。
此外，申請人應考慮外部因素相同的情況下，應進行申報試劑在相同或相似被測物的重復性檢測以評價檢測結果。申請人需對每個檢測條件和檢測區域下每個變異類型精密度分別進行報告，還應報告無應答或無效應答的百分比。
[1]《腫瘤相關突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用註冊技術審查指導原則》2019.12.05