1.在 B5 培養基上萌發擬南芥種子，當根長到 1-3 厘米時，就可以移栽到土壤中，溫室培養，光照 12h/12h，150μE。
2.準備壹個 90 毫米的培養皿，稱取 1.82 克 D-甘露醇加入 20 毫升雙蒸水中。用培養皿的蓋子剪取葉片。
3.從抽取階段前 4 周的葉片中取約 90 片。切成 1 毫米寬的條狀，放入甘露醇溶液中。可以邊切邊從植株上取下。
4.準備酶解液、100 毫升三角燒瓶、15 毫升酶解系統。
5.將步驟 3 中的細條撈出，放入酶解液中。黑暗中，23℃，40-50rpm酶解3小時。
6.酶解液過 100-200 目篩，過濾後的綠色混合物放入 15 毫升離心管（直徑約 1 厘米）中，平均分成兩管。4°C，60 克，15 分鐘，制動器調至 4-5。
7.棄去上清液，用冰冷的 W5 溶液輕輕洗滌沈澱，每管 4 毫升。4°C, 100 g, 1 min 棄上清液，用冰冷的 W5 溶液輕輕洗滌沈澱，每管 4 ml。冰浴 30 分鐘。
9.23°C，100g，1 分鐘，制動器設置為 4-5。棄去上清液，每管用 0.5 毫升 MaMg 重懸沈澱。(此步驟及後續操作均在 23°C 下進行）
10.取約 10-20ug 質粒於 1.5ml EP 管中，加入 100ul 步驟 9 中的原生質體。用 200ul 吸頭（剪去前端）輕輕混合。
11.加入 110ul PEG/Ca 溶液並輕輕混合。靜置 20-30 分鐘。
12.加入 0.44 毫升 W5 溶液，來回倒置混合。23°C，100g，1 分鐘，制動器調至 4-5。
13.棄去上清液，加入 100ul W5，混勻。加入 900ul W5 混勻。
14.將上述混合液置於六孔板中，23°C 避光培養 6-18 小時。
15.熒光觀察，觀察前取 100g，室溫下離心 2 分鐘，最終體積控制在 50ul 左右。 日本）
1.09 g 甘露醇
1ml 0.3M KCl
1ml 0.3M MES，pH 5.7
酶液在 55oC 下加熱 10 分鐘（滅活蛋白酶，提高酶的溶解度），冷卻至室溫後加入
1ml 0.15M CaCl2
1ml 0.75mM β-巰基乙醇
1ml 1.5% BSA
PEG 溶液（40%，v/v）
1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **非常重要!!!!！
0.75 ml H2O
0.625 ml 0.8 M 甘露醇
0.25 ml 1M CaCl2
W 5
1000 ml
154 mM NaCl 9.0 g
125 mM CaCl2 18.4 g
5 mM KCl 0.37 g
5 mM 葡萄糖 0.9 g
0.03% MES 0.3 g
H 至 5.8 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 bottles
MaMg solution
100 ml
15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2
0.1% MES 0.1 g
0.4 M mannitol 7.3 g
H to 5.6 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 ml bottles
References
1.Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts.