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用什麽化學方法檢測牛飼料中是否有朊病毒?

朊病毒檢測方法如下:

1動物傳播實驗

動物實驗是判斷生物是否感染朊病毒、確定感染滴度和研究朊病毒傳染性的主要手段。隨著檢測技術的發展,動物實驗的許多功能已經被更快、更準確的方法所取代,但作為壹種生物學方法,它仍然是朊病毒研究中不可或缺的重要環節。目前,大多數已知的朊病毒疾病都建立了動物感染模型,小鼠、大鼠和倉鼠是最常用的朊病毒實驗動物。

常規方法是用聚四氟乙烯研磨棒將無菌組織樣本勻漿,連續稀釋10倍。在每個稀釋度下,通常在腦中接種6只小鼠(10 ~ 30μl)、大鼠(30μl)或倉鼠(50μl)。接種動物每3天檢查1次,發現有毛發紊亂、駝背、動作遲緩、後肢麻痹等癥狀。之後,每天檢查並處死它們,取它們的腦組織進行病理學檢查以驗證朊病毒感染。如果接種的動物沒有發病,將繼續觀察直至死亡或及時盲傳,最後取腦組織進行病理檢查。根據動物的發病數和死亡數計算效價。這種方法的優點是靈敏,是研究朊病毒生物學特性的重要實驗。其缺點是費時、費力、滴定誤差大、消耗大量動物和價格昂貴。由於物種屏障、品系和動物個體的影響,傳播成功率往往差異很大,個別GSS品系的動物傳播從未成功過。因此,陰性試驗不能排除朊病毒感染,利用轉基因動物是壹種經濟實用的削弱或消除物種屏障的實驗方式,可明顯提高傳播效果。

2免疫學方法

免疫學檢測方法因其靈敏度高、特異性強、方法多,能滿足不同檢驗要求的需要,已成為檢測朊病毒的最主要方法。

(1)組織印跡:組織印跡技術是敏感蛋白檢測技術和解剖組織保存技術的結合,用於檢測組織中的微量PrPsc。它的靈敏度很高,甚至超過了壹般的免疫印跡法,在朊病毒研究中得到了廣泛的應用。

(2)斑點印跡:1990,Serban等人介紹了用硫氰酸胍處理的斑點印跡法。將組織樣品在冷裂解緩沖液中勻漿,然後以500轉/分鐘離心5分鐘以除去不溶性殘余物。取上清液與SDS樣品緩沖液等量混合,吸取4μl混合液,點於幹燥的NC膜上,晾幹,iK消化,3。斑點雜交法靈敏度低,但操作簡單,對儀器設備要求低,適合大批量標本的篩查,易於推廣。

(3) Western blot:由於使用了凝膠電泳分離技術和免疫分析技術,不僅可以識別樣品中的特定成分,還可以顯示其電泳分離圖譜,具有較高的應用價值。免疫印跡技術簡單、快速,對儀器設備要求低,不受組織自溶的影響。它能在組織病理學結果陰性或模糊的情況下檢測出PrPres,具有早期診斷的價值。目前已成為朊病毒研究中最常用的檢測方法之壹。基本步驟如下:經過壹系列處理,如勻漿、離心、蛋白酶K消化等。將待測組織樣品在12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳,然後將蛋白轉移到NC膜或PVDF膜上,密封,用特異性抗體進行免疫學檢測。

(4)免疫組織化學:免疫組織化學是利用特異性抗體在組織切片上直接顯示致病性PrP。由於它能在解剖上準確定位PrPres的沈積,為臨床病理診斷提供客觀依據,具有較高的臨床診斷價值。免疫組織化學可以檢測甲醛固定和石蠟包埋的組織樣本,應用範圍廣泛。基本步驟如下:甲醛固定或石蠟包埋的組織樣本經過壹系列預處理後,依次與特異性抗體和酶標二抗反應,最後加入底物顯色,顯微鏡下觀察。

(5)酶聯免疫吸附試驗(ELISA):該方法靈敏、特異、簡單、快速、定量、自動化,非常適合大批量標本的篩查。目前檢測朊病毒的ELISA方法有兩種:壹種是間接法,即將從每個標本中提取的PrPres包被在酶標板的孔中;另壹種是雙抗體夾心法,即先用特異性抗體包被酶標板,再加入樣品提取液,37℃孵育。之後在兩種方法中依次加入特異性1抗體和ELISA 2抗體,最後加入底物顯色,ELISA讀板。

(6)免疫學檢測中樣品預處理的幾點註意事項:①適當的樣品預處理可以暴露PrPres先前隱藏的表位和/或修復被福爾馬林破壞的表位,提高PrPres的免疫反應性,有利於實驗靈敏度的提高。②預處理不是萬能的,很多預處理都失敗了。預處理的效果可能取決於通過預處理暴露或修復的表位是否能被實驗中使用的抗體識別。③某些預處理方法(如高壓蒸汽處理)可同時增加PrPsen的免疫反應性,但這不利於PrPsen的檢測。橫山認為這只是由於PrPsen的低表達。④某些實驗中使用的抗體不能區分PrPres和PrPsen,也沒有用PK消化去除PrPsen。這些實驗的主要目的是利用PrPres和PrPsen之間的差異來篩選預處理條件,以盡可能增強與PrPres壹起使用的抗體的免疫反應性,抑制與PrPsen的免疫反應性,擴大兩者實驗結果的差異,從而達到篩選TSE感染生物的目的。⑤在不進行樣品預處理的情況下,僅通過選擇改良抗體也可以提高檢測的靈敏度。

3特殊儀器的檢測方法

(1)電鏡法:用電鏡檢測瘙癢相關纖維(SAF)是朊病毒檢測的另壹種方法。現在認為PrPsc是SAF的壹個組成部分。與瘙癢相關的纖維為桿狀、纖維狀結構,實際上是PrPsc在不同提取條件下用去汙劑提取的產物。在受感染生物體的組織切片中未發現SAF。基本步驟如下:將檢測組織在10% N-laruoyl肌氨酸溶液中勻漿,進行差速離心,PK消化,重懸於蒸餾水中,負染,電鏡觀察。顯微鏡下可見瘙癢所特有的兩種大分子纖維。電鏡檢查SAF的敏感性較低,不如western blot。

(2)毛細管SDS-凝膠電泳:該方法主要通過物理和化學方法——差速離心、超速離心、N-月桂酰肌氨酸鈉和PK處理來純化PrPsc,然後在Beckman P/ACE 5 500上進行毛細管SDS-凝膠電泳。根據各組分通過檢測器時在波長265438±04nm處的吸收峰的時間和峰形,可以鑒別瘙癢病的病原體PrPsc。該方法具有樣品用量少、無需免疫試劑、判斷直觀等優點。缺點是需要超速離心機和特殊毛細管電泳儀器。

(3)熒光標記肽鏈的毛細管電泳免疫分析:該方法基於免疫競爭原理,利用無區帶毛細管電泳結合免疫熒光技術檢測樣品中的微量PrPse。基本原理是用熒光標記人工合成的PrPsc特異性肽鏈(142 ~ 154),然後用壹定量的特異性抗體和羊腦提取液進行電泳。熒光標記的肽鏈與抗體結合後,其遷移率發生變化,因此與遊離標記的肽鏈分離。因為抗體的量只能結合50%左右的標記肽鏈,所以熒光標記的結合肽鏈與遊離標記的肽鏈相似。當羊腦提取液中有少量PrPsc時,由於它與標記肽鏈競爭結合抗體,結合肽鏈與遊離肽鏈的比例發生變化,這是儀器檢測到的。該方法靈敏度高,可檢測135 pg的PrPsc,可用於檢測低朊病毒水平的腦外組織(如血液)。

(4)雙色強熒光靶掃描法:該方法利用* * *聚焦雙色熒光相關分光鏡技術檢測極微量的朊病毒。其基本原理是利用致病PrPres的特性,在適當條件下自我復制和自發聚集,用綠色熒光標記重組PrP(rPrP)。正常構象的PrPres和rPrP結合後,大量構象異常的rPrP帽通過變構轉化被復制。由於PrPres在壹定條件下自發聚集,大量rPrP帽聚集在PrPres周圍,使其熒光強度比遊離RPRP高50倍。同時,為了增強實驗的特異性,加入紅色熒光標記的特異性單克隆抗體,使PrPres- rPrP覆蓋聚集體被紅色熒光標記。只有同時發出高強度紅色和綠色熒光的顆粒才能被檢測儀器判斷為PrPres。

目前,朊病毒領域的許多方面仍是空白或人類知之甚少,如朊病毒通過物種屏障傳播的程度、通過生物制品和臨床醫學傳播的危險性、其他傳播途徑的探索、朊病毒致病機理的研究等。很多問題都離不開朊病毒檢測,朊病毒檢測方法的發展必將為朊病毒研究開辟廣闊的前景。

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