硝酸還原酶的測定方法

原理

硝酸還原酶是植物氮素代謝作用中關鍵性酶，與作物吸收和利用氮

簡單易行，在壹般條件下都能做到。

紅色的偶氮染料。反應液的酸度大則增加重氮化作用的速度，但降低偶聯作用的速度，顏色比較穩定。增加溫度可以增加反應速度，但降低重氮鹽的穩定度，所以反應需要在相同條件下進行。這種方法非常靈敏，能測定每ml含0.5μg的NaNO2。

儀器藥品

721型分光光度計 真空泵（或註射器）

保溫箱 天平

真空幹燥器 鉆孔器

三角燒瓶 移液管

燒杯

0.1mol/L磷酸緩沖液，pH7.5（見附表2）。

0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3於1000ml蒸餾水中。

磺胺試劑：1g磺胺加25ml濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至100ml。

α—萘胺試劑：0.2gα—萘胺溶於含1ml濃鹽酸的蒸餾水中，稀釋至100ml。

NaNO2標準溶液：1g NaNO2用蒸餾水溶解成1000ml。然後吸取5ml，再加蒸餾水稀釋成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用時稀釋之。

操作步驟

1. ．將新鮮取回的葉片（蓖麻、煙草、向日葵、油菜、小麥、棉花等均可）水洗，用吸水紙吸幹，然後用鉆孔器鉆成直徑約1cm的圓片，用蒸餾水洗滌2梍3次，吸幹水分，然後於臺天平上稱取等重的葉子圓片兩份，每份約0.3—0.4g（或每份取50個圓片），分別置於含有下列溶液的50ml三角燒瓶中：(1)0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.5)5ml+蒸餾水5ml；(2)0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然後將三角燒瓶置於真空幹燥器中，接上真空泵抽氣，放氣後，圓片即沈於溶液中（如果沒有真空泵，也可以用20ml註射器代替，將反應液及葉子圓片壹起倒入註射器中，用手指堵住註射器出口小孔，然後用力拉註射器使真空，如此抽氣放氣反復進行多次，即可使圓片中的空氣抽去而沈於溶液中）。將三角燒瓶置於30℃溫箱中，使不見光，保溫作用30分鐘，然後分別吸

註意取樣前葉子要進行壹段時間的光合作用，以積累碳水化合物，如果組織中的碳水化合物含量低，會使得酶的活性降低，此時則可於反應溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能顯著增加

保溫30分鐘結束時，吸取反應溶液1ml於壹試管中，加入磺胺試劑2ml及α—萘胺試劑2ml，混合搖勻，靜置30分鐘，用比色計進行比色測

3. ．繪制標準曲線

與重氮化作用及偶聯作用的速度有關，溫度、酸濃度等都影響顯色速度，同時也影響靈敏度，但如果標準與樣品的測定都在相同條件下進行，則顯色速度相同，彼此可以比較。

吸取不同濃度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml於試管中，加入磺胺試劑2ml及α—萘胺試劑2ml，混合搖勻，靜置30分鐘（或於壹定溫度的水俗中保溫30分鐘），立即於分光光度計中進行測定，測定時的波長為520nm，比色，讀取吸光度或透光率。然後，以吸光度為縱坐標，NaNO2濃度為橫坐標。於毫米方格紙上繪制吸光度—濃度曲線。

實驗作業

1．試比較不同植物的酶活性。

2．試比較取樣前植物處於照光或黑暗條件下酶活性的不同。

參考文獻

1．陳薇、張德頤：1980。植物組織中硝酸還原酶的提取測定和純化，植物生理學通訊，1980(4)：45—49。

2．周樹、鄭相穆：1985。硝酸還原酶體內分析方法的探討，植物生理學通訊，1985(1)：47—49。

3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503.

4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336.

5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807

（華東師範大學張誌良）