1目的
1.1了解並掌握培養基的配制和包裝方法。
1.2掌握各種實驗室滅菌方法和技術。
原則2
培養基是微生物生長、繁殖和代謝的混合營養物。由於微生物的營養類型不同，對營養物質的要求也不同，實驗和研究的目的也不同，所以培養基的種類很多，使用的原料也不同。但從營養學的角度來看，培養基中壹般含有微生物必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素和水。此外，培養基還應具有適宜的pH值、壹定的緩沖能力、壹定的氧化還原電位和適當的滲透壓。
瓊脂是從瓊脂等海藻中提取的膠狀物質，是應用最廣泛的凝結劑。瓊脂制成的培養基在98 ~ 100℃融化，在45℃以下凝固。但反復融化後，其凝固性降低。
任何壹種培養基壹旦制成，都要及時徹底滅菌，進行純培養。壹般來說，培養基是用高壓蒸汽滅菌的。
3材料
3.1器具和材料
天平、稱量紙、牛角勺、精密pH試紙、量筒、帶刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏鬥、分裝架、移液管和移液管筒、培養皿和培養皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、細繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、消毒器、幹燥箱。
3.2藥物試劑
蛋白腖、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、馬鈴薯汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液和5%HCl溶液。
4流程
稱取藥物→溶解→調節pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包紮貼標簽→滅菌→傾斜或翹起平板。
5個步驟
5.1培養基的制備
5.1.1稱量藥品
根據培養基配方，依次準確稱取各種藥物，放入大小合適的燒杯中，不加瓊脂。蛋白腖易吸潮，要快速稱重。
5.1.2溶出度
用量筒取壹定量的蒸餾水(約65438+總量的0/2)倒入燒杯中。放在有石棉網的電爐上加熱，用玻璃棒攪拌，防止液體溢出。待各種藥物完全溶解後，停止加熱，補充水分。如果配方中有澱粉，先用少量冷水將澱粉調成糊狀，放在火上加熱攪拌，然後加入足量的水和其他原料，待完全溶解後再補水。
5.1.3來調節pH值。
根據培養基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調節至所需pH。pH值可通過PH試紙或酸度計測定。
5.1.4溶解瓊脂
必須在固體或半固體培養基中加入壹定量的瓊脂。瓊脂加入後，放在電爐上邊攪拌邊加熱，待瓊脂完全融化後停止攪拌，補水(水需要預熱)。註意控制火勢，防止介質溢出或燃燒。
5.1.5過濾和包裝
首先安裝過濾裝置(圖3-1)。如果是液體培養基，在玻璃漏鬥裏放壹層濾紙；如果是固體或半固體培養基，在漏鬥中放入多層紗布，或在兩層紗布之間放入薄脫脂棉，趁熱過濾。過濾後立即分裝。包裝時註意不要汙染管口或瓶口上的培養基，以免弄濕棉塞造成汙染。液體包裝的高度應為試管高度的1/4左右。固體的包裝容量為管高的1/5，半固體包裝試管壹般為管高的1/3；三角瓶的包裝數量不得超過三角瓶體積的壹半。
5.1.6繃帶標誌
培養基包裝好後，加上棉塞或試管帽，再包壹層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標註培養基名稱、制備組、名稱和日期。
5.1.7滅菌
上述培養基應按照培養基配方中規定的條件及時滅菌。普通培養基為121℃20min，保證滅菌效果，不破壞培養基的有效成分。滅菌後的培養基如需作為斜面固體培養基，應在滅菌後立即作為斜面放置(圖3-2)，斜面長度壹般不超過試管長度的1/2；半固體培養基滅菌後，垂直濃縮成半固體深層瓊脂。
5.1.8倒置板
將培養基在水浴中冷卻至45 ~ 50℃，立即倒平板。
5.2滅菌方法
滅菌是指殺死或破壞壹定環境中的所有微生物。滅菌方法可分為兩類:物理滅菌和化學滅菌。本實驗主要介紹物理方法之壹，即加熱滅菌。
熱滅菌包括濕熱滅菌和幹熱滅菌。通過加熱使細菌中的蛋白質凝結變性，從而達到殺菌的目的。蛋白質的凝固變性與其自身的含水量有關。含水量越高，凝結所需的溫度越低。在相同溫度下，濕熱的殺菌效果大於幹熱，因為在濕熱的情況下，細菌吸水，使蛋白質容易凝固；同時濕熱滲透力強，可增加殺菌效果。
5.2.1.高壓蒸汽滅菌法
高壓蒸汽滅菌用途廣泛，效率高，是微生物學實驗中最常用的滅菌方法。這種殺菌方法是基於水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理而設計的。當蒸汽壓力達到65438±0.05kg/cm2時，蒸汽溫度上升到65438±0.265438±0℃，經過65438±0.5 ~ 30min，可殺滅鍋內物品上的各種微生物及其孢子。壹般的培養基、玻璃器皿、傳染性標本、工作服都可以用這種方法滅菌(圖3-4)。
5.2.1.1操作方法及註意事項如下。
澆水
打開滅菌鍋蓋，向鍋內加水至水位。最好使用立式消毒鍋的開水，減少鍋內水垢的堆積。滅菌時註意加足水，防止幹鍋。
裝載和封蓋
滅菌材料放好後，關閉滅菌器蓋，對角擰緊蓋上的螺絲，使蒸鍋氣密，避免漏氣。
發泄
打開排氣口(也稱為放氣閥)。用電爐加熱。當水沸騰時，蒸汽和空氣會壹起從排氣孔排出。當大量蒸汽排出時，將保持5分鐘，使鍋內的冷空氣完全排出。
增壓、保持和減壓
當鍋內的冷氣排盡後，可以關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力升至所需壓力時，控制電壓維持恒溫，開始計算滅菌時間。時間達到要求後(壹般培養基和器皿滅菌控制在121℃20min)，停止加熱，當壓力降至“0”附近時，打開空氣閥。註意排氣不要太早太快，否則瓶內液體會沖出容器，因為瓶內壓力下降速度比鍋內慢。
無菌培養基空白培養
滅菌後的培養基在37℃的培養箱中培養，無菌生長24小時後即可保存備用。斜面培養基取出後，立即放入斜面，然後在空白中培養；半固體培養基垂直放置，濃縮成半固體深層瓊脂，然後空白培養。
幹熱滅菌法
利用幹熱空氣殺滅微生物的方法稱為幹熱滅菌。壹般要滅菌的物品包裝好放在電烤箱裏烘烤，即加熱到160 ~ 170℃1 ~ 2h。
幹熱滅菌常用於對空的玻璃器皿和金屬器皿進行滅菌。任何有橡膠、液體和固體培養基的東西都不能用這種方法滅菌。
滅菌前的準備
玻璃器皿滅菌前壹定要包好塞好，保證滅菌後玻璃器皿不會被外界雜菌汙染。常用玻璃器皿的包塞方法有:用紙包好盤子或裝在金屬板管中；三角瓶在棉塞和瓶口外用厚紙包裹，用帶活結的棉繩紮緊，防止滅菌後瓶口被外界雜菌汙染；吸管的壹端用拉直的回形針放在棉花中央，輕輕戳進噴嘴。松緊壹定要適中，噴嘴露出的棉纖維要被火焰均勻燃燒。消毒時將吸管放入金屬管內消毒，也可從吸管尖端斜包壹張紙，逐漸卷起。把頭端的紙卷壓平，擰幾下，然後把包好的吸管集中消毒。
5.2.2.2幹燥箱滅菌
將包裹好的物品放入烘箱，註意不要放得太近，以免阻礙空氣流通；不要讓器具直接接觸烤箱的內層。將烘箱溫度升至160 ~ 170℃，並保持恒定在1 ~ 2h。註意不要讓溫度過高。如果超過170℃，包裹在容器外的紙和棉花就會被燒焦，燃燒。如果是烘幹玻璃器皿，溫度為120℃，時間為30分鐘。當溫度降至60 ~ 70℃時，可打開門取出物品，否則玻璃器皿會因突然冷卻而爆裂。
用這種方法消毒時，千萬不要用油或蠟紙包東西。
5.2.2.3火焰滅菌
直接火焰燃燒殺菌，快速徹底。對於接種環、接種針或其他金屬器具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進行滅菌。另外，在接種的過程中，試管或三角瓶口也是經過火焰滅菌的。
6個結果
6.1記錄滅菌方法和滅菌條件(溫度、壓力等。)用於各種物品。
6.2請描述高壓蒸汽滅菌的過程及註意事項。
7思考
7.1配制培養基的壹般程序是什麽？
7.2做了這個實驗後，妳覺得配制培養基需要註意什麽？
7.3微生物學實驗中滅菌的意義是什麽？
試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。
5高壓滅菌需要註意什麽？