最佳的插入片段:載體比例需要通過實驗來確定。1: 1(插入:向量)往往是最佳比例，1: 8或8: 1的摩爾比也是可以接受的。應確定比率範圍。對於連接，5ul 2X連接酶，50ng質粒DNA，1Weiss單位的T4連接酶，和插入片段***10ul。保持溫度在室溫65438±0小時，或在4℃過夜。在這兩個溫度下，缺乏T- projection的載體會自我連接，產生藍點。在室溫下保持溫度1小時可以滿足大部分克隆要求。為了提高連接效率，需要在4℃過夜。
2)2)PCR產物需要凝膠純化嗎？
比如凝膠分析只有壹條帶，不需要凝膠純化。如果還能看到其他條帶，可能是二聚體積累了大量引物。少量的引物二聚體也具有高摩爾數，這將產生高比例的具有引物二聚體的克隆，而不是目標插入片段。所以克隆前需要凝膠純化。
3)如果沒有回收到目標片段，需要做什麽對照實驗？
a)包被未轉化的感受態細胞。
如果有菌落，說明氨芐青黴素無效，或者有氨芐青黴素抗性的質粒被汙染，或者產生了氨芐青黴素抗性的菌落。
b)轉化完整質粒，計算菌落生長數，並確定轉化效率。
例如稀釋1ug/ul質粒1:100，用1ul轉化100ul感受態細胞。用SOC稀釋到1000ul後，在板材上鋪100ul。過夜培養後，產生了1000個菌落。轉化率為:產生的菌落總數DNA擴散總數。
鋪板DNA的總量是轉化反應中使用的量除以稀釋倍數。具體來說，用10ng DNA進行轉化，用SOC稀釋到1000u後含有10 ng DNA，用1/10進行鋪展，* *用1 ng DNA。轉換率為:
1000克隆x 103 ng/plank 1 ng DNA ug = 106 cfu/ug。
用108cfu/ ug感受態細胞轉化PGEM-T。
如果沒有集落或集落很少，說明感受態細胞的轉化率太低。
c)用pGEM-T陽性對照或PCR產物產生>:20-40個藍點(用指定的step 108cfu/ug感受態細胞)，說明載體丟失了T，可能是那個連接酶汙染了核酸酶。T4DNA連接酶(M1801，M1804，M1794)質量標準好，無核酸酶汙染，其他來源的T4 DNA連接酶不宜替代。
d)用pGEM-T或pGEM-T Easy vector轉化高頻感受態細胞(108cfu/ug)，按規定的實驗步驟，可獲得100個菌落，其中60%應為白斑，如>:20-40個藍點，無菌落或菌落少，連接問題。
4)對照實驗的結果是好的，但是沒有回收到目標片段。實驗有什麽問題？
a)連接在室溫下保持65438±0小時，可以滿足大部分克隆。為了提高效率，需要在4℃過夜。
b)插入的片段被汙染，導致3’-T的缺失，或連接和轉化的抑制。因此，將插入的片段與pGEM-T陽性對照混合，然後連接。如果對照的菌落數減少，插入的片段需要純化或重新制備。如果產生大量藍點，說明插入的片段被核酸酶汙染，使pGEM-T或pGEM-T易載體3′-T缺失。
c)插入片段不適合連接。由於過度的紫外線照射，有時會出現凝膠純化的插入物。過多的紫外線照射會產生嘧啶二聚體，不利於連接，DNA必須再次純化。
d)具有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端沒有A，這是克隆pGEM-T或pGEM-T Easy載體所需要的。加入Taq DNA聚合酶和核苷酸可以在末尾加壹個。詳情請參考pGEM-T pGEM-T Easy carrier (TM042)的技術數據。
e)高度重復的序列可能不穩定，導致擴增過程中的缺失和重排。如果發現插入片段經常被刪除和重排，應使用重組缺陷型大腸桿菌菌株，如SURE細胞。
PCR反應系統和反應條件
標準PCR反應系統:
10×擴增緩沖液10ul
四種dNTP混合物中的每壹種為200 μm ol/L。
每個引物為10 ~ 100 pmol。
模板DNA 0.1 ~ 2ug
Taq DNA聚合酶2.5u
Mg2+1.5毫摩爾/升
向100微升中加入雙份或三份蒸餾水。
PCR反應五要素:參與PCR反應的物質主要有五種，分別是引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
引物:引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決於引物與模板DNA的互補程度。理論上，只要已知任何模板DNA的序列，就可以根據它設計互補的寡核苷酸鏈作為引物，通過PCR在體外擴增模板DNA。①引物長度:15-30bp，壹般在20bp左右。
②引物擴增跨度:200-500bp為宜，在壹定條件下可擴增到10kb片段。
③引物庫:參照引物設計的基本原則。
(4)避免引物中的二級結構，避免兩條引物之間的互補性，尤其是3’端的互補性，否則會形成引物二聚體，產生非特異性擴增帶。
⑤引物3’端的堿基，尤其是最後壹個和倒數第二個堿基要嚴格匹配，避免末端堿基錯配導致PCR失敗。
⑥引物中存在或可以存在合適的酶切位點，擴增的目的序列最好有合適的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆非常有利。
⑦引物特異性:引物應與核酸序列數據庫中的其他序列無明顯同源性。引物量:每種引物的濃度為0.1 ~ 1 umol或10 ~ 100 pmol，最低的引物量更好產生所需的結果。較高的引物濃度會造成錯配和非特異性擴增，增加引物間形成二聚體的機會。目前可用的Taq DNA聚合酶有兩種，壹種是從水熱芽孢桿菌中純化的天然酶，另壹種是大腸桿菌合成的基因工程酶。催化壹個典型的PCR反應大約需要2.5U的酶(當總反應體積為100ul時)。濃度過高會引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
dNTP的質量和濃度
dNTP的質量和濃度與PCR擴增的效率密切相關。dNTP粉末呈顆粒狀，保存不當會失去生物活性。DNTP溶液呈酸性，應在高濃度後用1M NaOH或1M Tris配制。將HCL緩沖液的PH值調至7.0 ~ 7.5，少量分裝，冷凍於-20℃。反復凍融會降解dNTP。在PCR反應中，dNTP應在50 ~ 200 μm ol/L，特別是四種dNTP的濃度應相等(等摩爾配制)。如果其中任何壹個和其他的不壹樣(更高或更低)，就會造成不匹配。過低的濃度會降低PCR產物的產量。DNTP能與Mg2+結合，降低遊離Mg2+的濃度。
模板(靶基因)核酸模板核酸的數量和純化程度是PCR成敗的關鍵環節之壹。傳統的DNA純化方法通常使用SDS和蛋白酶K來消化和處理樣品。SDS的主要作用是:溶解細胞膜上的脂質和蛋白質，從而溶解膜蛋白破壞細胞膜，遊離細胞內的核蛋白。SDS也能與蛋白質結合沈澱；蛋白酶K能水解和消化蛋白質，尤其是與DNA結合的組蛋白，然後用有機溶劑苯酚和氯仿提取蛋白質和其他細胞成分，用乙醇或異丙醇沈澱核酸。提取的核酸可以用作PCR反應的模板。在壹般的臨床樣本中，可以用壹種快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化染色體的蛋白質，使目的基因遊離出來，直接用於PCR擴增。RNA模板的提取通常采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，防止RNA酶降解RNA。Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產量有顯著影響。在壹般的PCR反應中，當各種dNTP的濃度為200 μm ol/L時，Mg2+的適宜濃度為1.5 ~ 2.0 mmol/L..Mg2+濃度過高，反應的特異性會降低，出現非特異性擴增。濃度過低，Taq DNA聚合酶的活性會降低，反應產物也會減少。PCR的反應條件是溫度、時間和循環次數。
溫度和時間的設定:基於PCR原理，設定變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中，使用三溫點法。雙鏈DNA在90 ~ 95℃變性，然後迅速冷卻到40 ~ 60℃。引物退火後與靶序列結合，然後快速加熱至70 ~ 75℃。在Taq DNA聚合酶的作用下，引物鏈沿著模板延伸。對於較短的靶基因(長度為100 ~ 300 BP時)，可采用雙溫點法，除變性溫度外，可結合退火和延伸溫度。壹般94℃變性，65℃左右退火延伸(在此溫度下，Taq DNA酶仍具有較高的催化活性)。
①變性溫度和時間:變性溫度低和熔化不完全是PCR失敗的主要原因。壹般來說，93℃ ~ 94℃的時間足以使模板DNA變性。如果低於93℃，需要延長時間，但溫度不能太高，因為高溫環境對酶的活性有影響。如果目標基因模板或PCR產物在這壹步不能完全變性，PCR就會失敗。
②退火(復性)溫度和時間:退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。變性後迅速降溫至40℃ ~ 60℃，可使引物與模板結合。因為模板DNA比引物復雜得多，所以引物和模板之間碰撞結合的幾率比模板互補鏈之間的幾率高得多。退火溫度和時間取決於引物的長度、堿基組成和濃度以及靶序列的長度。對於20個核苷酸和50% G+C含量的引物，55℃是選擇最佳退火溫度的理想起點。引物的復性溫度可以通過下面的公式幫助選擇合適的溫度:
Tm值(熔化溫度)=4(G+C)+2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5 ~ 10℃)
在Tm值允許的範圍內，選擇較高的復性溫度可以大大降低引物與模板的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間壹般為30 ~ 60秒，足以使引物和模板完全結合。
③延伸溫度和時間:Taq DNA聚合酶的生物活性；
70 ~ 80℃ 150個核苷酸/秒/酶分子
70℃時60個核苷酸/秒/酶分子
55℃時24個核苷酸/秒/酶分子
當溫度高於90℃時，DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度壹般為70 ~ 75℃，常見溫度為72℃。過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間取決於待擴增片段的長度。壹般對於1Kb以內的DNA片段，1min的延伸時間就足夠了。3 ~ 4 KB的靶序列耗時3 ~ 4min；10Kb的擴增需要延伸到15min。過長的延伸會導致非特異性擴增帶的出現。對於低濃度模板的擴增，延伸時間稍長。按要求有4個PCR實驗室，分別是1試劑儲存和制備區、2樣品制備區、3擴增反應混合物制備和擴增區、4擴增產物分析區。布局見圖1。圖1四個PCR實驗室的區域設置
如果使用全自動分析器，可以適當地合並區域。我們建議將擴增區和產物分析區合並成三個擴增檢測區，即* * *。布局見圖2。
圖2三個PCR實驗室的區域設置
根據衛生部的要求，進入每個工作區必須嚴格遵循單壹方向，即只能從試劑儲存和制備區進入？標本制備區擴增反應混合物制備和擴增區？擴大產品分析區域以避免交叉汙染。每個工作區域必須安裝適當的通風設備，以確保空氣流動方向單壹。工作區域的墻壁、地板和辦公用品必須由耐消毒藥物的材料制成。工作區域必須有清晰的標記，以避免不同工作區域的設備和物品混淆。每個工作區域必須配備排氣扇、空調、耐腐蝕地板和臺面、儲物櫃、鞋櫃、專用辦公用品、專用工作服、工作鞋、移動紫外線燈等。以確保安全和健康的需要。
根據衛生部臨床基因擴增實驗室基本設置標準，各工作區所需儀器設備如下:
試劑儲存和制備區
1.2-8℃和-15℃的冰箱
2.攪拌器
3.微量取樣器(覆蓋1-1000微升)
4.移動紫外線燈(靠近工作臺)
5.耗材:壹次性手套、壹次性吸水紙、耐高壓離心管、采樣器吸頭(帶濾芯)。
6.特殊工作服和工作鞋
7.特殊辦公用品
兩個標本制備區
1.2-8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱
2.高速臺式冷凍離心機
3.攪拌器
4.水浴箱或加熱模塊
5.微量取樣器(覆蓋1-1000微升)
6.可移動紫外線燈(靠近工作臺)
7.凈化臺
8.消耗品:與“試劑儲存和制備區”中的消耗品相同
9.特殊工作服和工作鞋
10.特殊辦公用品
如果需要處理大分子DNA，要有超聲波水浴儀。
三個基因擴增區和產物分析區
1.全自動定量核酸擴增儀(包括電腦和打印機)
2.微量取樣器(覆蓋1-1000微升)
3.可移動紫外線燈(靠近工作臺)
4.消耗品:與“試劑儲存和制備區”中的消耗品相同
5.特殊工作服和工作鞋
6.特殊辦公用品
每個工作區域都必須有清晰的標記，以避免不同工作區域的設備和物品混淆。不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標誌的工作服，以便識別。當工人離開工作區時，他們不允許拿出每個區的特定工作服。
3.實驗室質量管理
PCR實驗室的工作人員必須參加衛生部或省級臨床檢驗中心組織的臨床基因擴增培訓班，並持有相關證書。PCR實驗室通過驗收，至少有兩個實驗室必須持有“臨床基因檢測合格證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、標準操作規程(SOP)等壹系列質量管理文件，以保證實驗室的日常運行符合衛生部的要求，保證檢測結果的準確性，保證實驗室的衛生安全，保證實驗室的長期穩定運行。1.觸地PCR:溫度在前幾個循環中逐漸降低。
2.反轉錄PCR(RT-PCR):以mRNA反轉錄的DNA為模板，得到的DNA不含內含子(基因中無意義的段落)，這是分子克隆技術中常用的方法。
3.熱啟動PCR:與高熱激活的核酸聚合酶反應，減少非特異性產物。
4.實時PCR:在PCR過程中使用熒光探針或染料進行定量檢測，也稱為定量PCR。
5.巢式PCR:先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數，再用高特異性引物擴增。
6.多重PCR:在同壹個試管中使用多組引物。
7.重整PCR:將PCR產物稀釋10倍，然後放入原始濃度的引物和dNTP中三次，以消除產物中的異二聚體。
8.dsRNA復制子:高保真DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、PHi6RNA復制子壹起使用；從雙鏈DNA轉錄成相應的雙鏈RNA(dsRNA)。它可以應用於RNAi的實驗操作。
9.冷PCR(Co-amplification atlas transformation temperature-PCR):壹種用於檢測突變或特殊等位基因的PCR應用技術。