1分離方法
分離純化的方法應根據提取的組織材料、提取材料的性質來確定。蛋白質、多肽提取分離常用的方法有：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沈澱法、離子交換色譜法、親和層析法、吸附層析法、逆流分配法、酶解法等。這些方法常常結合在壹起用於特定物質的分離和純化，同時，這些方法也常用於蛋白質和肽的分析，如層析、稱遊等。
1.1高效液相色譜法（HPLC）
高效液相色譜法的出現為多肽的分離提供了有利的方法手段，因為應用高效液相色譜法分離蛋白質、多肽與其他化合物相比，在合適的色譜條件下，不僅可以在短時間內完成分離的目的，更重要的是，高效液相色譜法能夠制備具有生物活性的多肽。肽。因此，許多學者在尋找多肽分離制備的最佳條件方面做了大量工作。如何保持多肽的活性、如何選擇固定相材料、洗脫液的類型、如何分析判斷等都是目前研究的重點。
1.1.1反相高效液相色譜法（RP-HPLC）
結果與保留值的關系：用RP-HPLC分離多肽首先要確定不同結構的多肽在色譜柱上的保留。為了獲得壹系列保留系數，Wilce 等人分析了 250 種肽的保留特性和結構。利用多元線性回歸分析了 2106 種多肽的保留特性和結構，得出了不同氨基酸組成對保留系數的影響關系，其中由 2-20 個氨基酸組成的多肽中的極性氨基酸殘基可縮短在色譜柱上的保留時間、在由 10-60 個氨基酸組成的多肽中，更多的非極性氨基酸也能縮短在色譜柱上的保留時間，而在含有 5-25 個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸的增加能延長在色譜柱上的保留時間。同時，大量文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留的影響，通過計算機處理分析，得到了各肽段分離提取的最佳條件。
肽圖分析：肽圖分析是根據蛋白質和肽的分子量大小以及氨基酸組成的特點，利用較為特異的蛋白質水解酶[壹般不是肽鏈內切酶(endopeptidase)]在特殊肽鏈位點的作用將肽裂解成小片段，通過壹定的分離和檢測手段形成特征指紋，即肽指紋。通過壹定的分離和檢測手段，形成特征指紋，肽圖分析對肽結構研究和特征鑒定具有重要意義。利用胰蛋白酶能特異性作用於 Arg 和 Lys 羧基末端肽鏈的特點，采用 C18 色譜柱，通過 RP-HPLC 方法檢測了重組人生長激素的胰蛋白酶肽圖譜。此外，胰島素的肽圖是由 V8 酶獨家裂解產生的，因此可以識別不同物種來源的胰島素，它們之間只有壹個氨基酸殘缺的區別。通過酶裂解和在線分析，還確定了人腫瘤壞死因子單克隆抗體的結構，為鑒定和分析提供了便利。該技術已廣泛應用於新藥研發。
1.1.2疏水相互作用色譜（HIC）
HIC是利用肽中含有疏水基因，可與固定相發生疏水作用而達到分離分析的目的，它具有比RP-GPLC使肽變性少的特點。Geng等利用HIC柱的低變性特性，通過對大腸桿菌表達的鹽酸乙酸乙酯胍進行變性，獲得人重組幹擾素-γ，並通過HIC柱純化和折疊，得到生物活性較高的產物。不同的人尿表皮生長因子（EGF）也通過 HIC 得到純化，它們都具有良好的生物活性。HIC 不需要離子交換柱就能純化樣品，而 RP-HPLC 則無法做到這壹點。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子的大小和形狀差異來分離純化多肽物質，特別是對壹些聚集狀態較大的分子分離更為方便，如分離人重組生長激素（hgH）時，不同結構、構型的GH在SEC柱上的分離行為完全不同，因此可以分離構型不同或氨基酸序列有細微差別的變體。SEC 用於研究改性 PEG 的分離方法，其特點是半衰期長、作用強。壹些分子量較大的肽或蛋白質可以用這種方法進行分離和分析。
1.1.4離子交換色譜法（IEXC）
離子交換色譜法可利用肽帶電性質的差異，在中性條件下分離純化具有生物活性的肽。它可分為陽離子柱和陰離子柱兩大類，還有壹些新型樹脂，如大孔樹脂、均質孔樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽物質的分離分析研究中，對多肽性質、洗脫液、洗脫條件的研究較多，不同多肽的分離條件不同，尤其是洗脫液的離子強度、鹽濃度等對純化的影響較大。Wu等報道了利用離子交換柱色譜法分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件探討，為今後此類物質的分離研究提供了有價值的數據。
1.1.5膜蛋白色譜法（Chromatography of Membrane Protein，CMP）
CMP+分離強菜水蛋白、多肽混合物的色譜體系，壹般有除垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融合膜蛋白，並由羥基磷灰石作為固定相的色譜柱分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端）和陽離子鈣基（C-端），這與固定相有關，固定相主要由膜蛋白的大小和 SDS 結合量決定。利用原子散射法研究了cAMP的分離機理，發現樣品與SDS結合後，離子交換柱上的固定相中SDS分子、帶電氨基酸和帶電離子之間發生了交換，從而達到了分層分離的目的。
1.1.6 高效置換色譜（HPDC）
HPDC 是利用小分子高效置換劑在色譜柱上交換樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量少的特性。HPDC 被用來鑒定和分離活性人重組生長激素（rHG），其含量小於總餾分的 1%。在對無毒交換劑的研究中，Jayarama 發現硫酸代特朗（Detran Sulfate，DS）是 β-乳球蛋白 A 和 B 的良好置換劑。研究表明，置換劑的相對分子質量越小，就越容易與固定體結合，因此在分離相對分子質量較小的多肽時，需要使用較小的置換劑進行置換純化。
1.1.7 灌註色譜法（PC）
PC 是壹種基於分子篩原理和流動相高速流動的色譜分離方法，固定相孔徑的大小和流動相的流速直接影響分離效果。試驗證明，它在生產制備過程中具有低投入、高產出的特點。目前，市場上 PC 固定相的種類很多，適用於不同分子量肽的分離。
1.2 親和層析（AC）
AC 是利用固定相基質上附著的配體與能與其發生特異性作用的配體之間的特異性親和力來分離物質的壹種層析方法。自 Cuatrecasas 於 1968 年提出親和層析的概念以來，在尋找特異性親和作用物質的過程中發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸及其互補鏈等。對於肽的分離，主要應用於其單克隆抗體或生物模擬配體的親和性，這些配體可以是天然的，也可以是根據其結構合成的。Patel 等人利用壹系列親和柱分離純化了壹種組織血漿纖溶酶原激活蛋白肽。
固定金屬親和層析（LMAC）是近年來發展起來的壹種親和法。其固定相基質螯合了壹些金屬離子，如 Cu2+、Ni2+、Fe3+ 等。該柱可用於鍵合螯合含Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His側鏈的多肽，尤其是含His-X-X-X-His結構的多肽序列最易與親和柱上的金屬離子結合，純化效果更好。其中，Insylin Like Growth Factor (IGF)、dihydroleaf reductase fusion protein等通過該方法分離得到純度較高的產物。
Chaiken等人報道了另壹種親和層析方法，利用反義DNA表達產生的，與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白質具有壹定親和力的肽或蛋白質，如Arg加壓激素受體復合物，就是用這種方法分離出來的。DNA與蛋白質、肽復合物的作用也常用於生物親和層析。將合成的寡核苷酸與固定相基質結合，樣品蛋白質或肽流經色譜柱，與之結合後可實現肽的特異結構分離。
1.3毛細管電泳（CE）--分離分析方法
毛細管電泳是在20世紀60年代末Hjerten發明的傳統電泳技術基礎上發展起來的，它利用小毛細管代替了傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。根據應用原理的不同，CE 可分為以下幾種類型：毛細管區帶電泳（CZE）、毛細管等離聚焦電泳（Capillary-IEF）、等離聚焦電泳（Isoeletric Focusing）和等離聚焦電泳（IF）。等離聚焦電泳（CIEF）、毛細管凝膠電泳（CGE）和微粒動電泳（MECC）等。MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（CZE）
毛細管區帶電泳主要根據不同餾分中的帶電化合物來分離多肽，比傳統的凝膠電泳更準確。目前，CZE分離分析多肽的主要問題是天然蛋白質或多肽容易與毛細管矽膠柱上的矽烷醇發生反應，從而影響峰形和電泳時間。為了改善這壹問題，許多學者做了大量實驗，如調整細胞遊泳液的 PH 值，減少與矽烷醇反應的極性基團；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽的不同性質采用不同的方法等。CZE法研究了含9個氨基酸殘基的5種小肽的分離，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有壹定濃度的Zn2+等金屬離子，此時分離快速準確。
1.3.2 細管等電聚焦（Capillary Isleletric Focusing，CIEF）
多肽作為不同的蛋白質，具有不同的等電點（PI），因此在不同PH梯度的電泳槽中，在等電點PH條件下，多肽可以聚集沈澱，與其他多肽分離。CIEF 在混合肽物質的分離和分析中應用不多，主要用於不同來源肽異構體之間的分離，如 rHG 不同異構體的分離。CIEF 色譜柱表面覆蓋物的不穩定性限制了該方法的廣泛應用。
1.3.3 毛細管凝膠電泳（CGE）
毛細管凝膠電泳是基於分子篩分原理，用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理的蛋白質或肽在電泳過程中主要通過分子形狀和分子量的差異進行分離。目前，還有壹種非交聯的螯合、線性、疏水性聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，這種電泳方法適用於分離含有較多疏水側鏈的多肽，這種凝膠易於灌流，使用壽命長，性能較為穩定。
1.3.4 微束電動電泳層析（MECC）
MECC 的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如 SDS，使壹些帶相同電荷分子的中性分子分離出來。MECC 的原理是在電泳溶液中加入 SDS 等表面活性劑，使壹些帶相同電荷的中性分子得以分離。特別是對於壹些小分子肽，陰陽離子表面活性劑的應用可以使其形成帶有壹定電荷的膠束，從而獲得良好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可利用含有疏水結構成分的多肽的選擇權和環糊精環的孔隙作用，從而利用多肽的疏水作用使其分離。
1.4多肽蛋白質分離工程的系統應用
上述多肽分離技術在實際應用過程中，多相互結合，根據多肽分離性質的不同，采用不同的分離手段。特別是在後基因組時代，對蛋白質組的深入研究，人們對於多肽和蛋白質的分離手段不斷改進，綜合利用蛋白質和多肽的各種特性，包括前面提到的常規多肽提取方法，同時利用高效液相色譜、毛細管電泳、二維電泳等分離手段，盡可能多地得到細胞或組織中的蛋白質和多肽。在蛋白質組學研究中系統地應用蛋白質和肽的分離鑒定技術，是本研究的分離分析方法之壹。特別是下面提到的質譜技術的發展，大大提高了蛋白質和肽的分析鑒定效率。
2 分析方法
2.1 質譜（MS）
質譜在蛋白質和多肽的分析中得到了廣泛的應用，尤其是在分離純化後的在線分析中，質譜的高靈敏度和快速性特別適合多肽物質的分析鑒定。其中，連續流快速原子轟擊（cf-FAB）和電噴霧離子化（EIS）是近年來發展起來的新方法。
2.1.1 連續流快速原子轟擊法（cf-FAB）
cf-FAB是壹種弱電離技術，可將多肽或小分子量蛋白質電離成MH+或（M-H）形式。它主要應用於肽的分離和檢測，分辨率中等，準確度大於 +0.2amu，流速為 0.5-1.5 μl-ml-1。cf-FAB 常與 HPLC、CEZ 等結合使用，以達到分離和分析的目的。許多肽類化合物的 cf-FAB 分析方法已經建立並得到了很好的應用。例如，Hideaki 等人利用這種方法研究了壹系列由 L-Pro 和 L-Ala 組成的四肽化合物，結果表明 L-Pro 在維持小肽構象相穩定性方面具有重要作用。連接分子具有重要意義。
2.1.2 電噴霧離子化質譜（EIS）
EIS 對蛋白質或肽段進行多價離子化，可分析相對分子質量達 1×105 蛋白質的蛋白質，分辨率為 1500-2000 amu，準確度約為 0.01%。EIS 更適合在線分析相對分子質量較大的蛋白質。EIS 更適合在線分析相對分子質量較大的蛋白質，但需要氣化或有機溶劑使樣品敏化。利用 EIS 與 HPLC 結合對 GH 和血紅蛋白進行分離和分析已取得成功，它也可與 CEZ 結合使用。
2.1.3 基質相關激光分解/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF MS 是鑒定蛋白質最有效的方法。MALDI-TOF 是蛋白質鑒定中測定分子質量的壹種精確手段，尤其適用於測定混合蛋白質和肽的相對分子質量，具有高靈敏度和高分辨率。它是蛋白質組學研究的必要工具。同時，結合液相色譜技術可以高效鑒定多肽物質。尤其是將質譜的各種原理串聯起來應用，不僅可以得到多肽的相對分子質量，還可以確定其序列結構，這項技術將在未來的蛋白質組學研究中起到決定性的作用。
2.2 核磁共振（NMR）
核磁共振在蛋白質和肽的分析中應用不多，原因是信號純數字化、重疊範圍過大（由於相對分子質量過大）、核信號較弱。隨著二維、三維和四維核磁共振的應用，分子生物學和計算機處理技術的發展，核磁共振已逐漸成為分析這類物質的主要方法之壹，可用於測定氨基酸的序列、定量混合物中各組分的含量等。然而，將其應用於蛋白質分析仍有壹定難度。然而，蛋白質分析仍有許多問題有待解決，例如，如何使分子量較大的蛋白質具有特定的形狀以方便定量和定性分析，如何減少數據處理的時間等等。許多學者都對這些問題進行了研究。核磁共振雖然在蛋白質分析中應用較少，但在分析分子中含有小於 30 個氨基酸的小肽時非常有用，它可以克服蛋白質分析中的上述缺點，達到快速準確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法外，氨基酸組成分析法、氨基酸序列分析法、現場分析質譜法、紅外光譜法、紫外光譜法、CD法、環和色譜法、生物鑒定法、放射性同位素標記法和免疫學方法等都已用於多肽的鑒定結果、分析檢測。
以上簡要介紹了近年來多肽分離分析的常用方法和最新研究方向。隨著科學技術的不斷發展，還會有許多更新的分離分析手段出現，因此該領域的研究具有廣闊的前景。
SDS-PAGE在顯示小分子肽方面的應用
SDS-PAGE在蛋白質的分離、鑒定和純化方面有著廣泛的應用，其有效分離範圍取決於聚丙烯酰胺的濃度和交聯度，其孔徑隨雙丙烯酰胺與丙烯酰胺比例的增加而減小，當比例接近1:20時達到最小值。分子量小於 10kD 的小分子肽即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行 SDS-PAGE 也不能完全分離，要麽顯示不明顯，要麽顯示微弱且彌散的條帶。而且分子量越小，效果越差。
為了能在 SDS-PAGE 上顯示小分子量肽的測定結果，通常采取兩種方法：壹是提高凝膠的濃度和交聯度，在制備凝膠時加入壹些能降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑網限的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中拖尾離子的種類和濃度，以達到提高多肽的分離效果。
操作步驟
1.電泳緩沖液的配制如下表所示
緩沖液Tris
（mol/L）Tricine
（mol/L）pHSDS
（%）
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0-
0.1
-8.9*
8.25**
8.4*-
0.1
0.3
* 用鹽酸調節 pH
** pH 約 8.25
2. 配制丙烯酰胺貯存液
單丙基-二丙基混合物 % 單丙基 % 二丙基
49.5% T，3%C
49.5% T，6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯酰胺總濃度
C：交聯度
3.膠的制備與壹般 SDS-PAGE 相似，分離膠和濃縮膠按下表制備
組別 分離膠
16% T，6%C 濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T，3%C 丙烯酰胺溶液（毫升）
49.5% T，6%C 丙烯酰胺溶液（毫升）
凝膠緩沖液（毫升）
尿素（克）[甘油（毫升）]
水（毫升）
10% 過硫酸銨（微升）
TEMED（微升）
總體積（毫升）-
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
-
1.00
-
1.50
25
2.5
3.03
4. 樣品緩沖液
4% SDS
12% 甘油
50mmol/L Tris
2% 巰基乙醇
0.01% 瑟伐藍
多肽樣品與樣品緩沖液混合後煮沸 2 分鐘（或 40°C 溫浴 30 分鐘）。
5.將灌註好的玻璃板固定在電泳儀上，用 1%瓊脂糖封住邊緣，倒入陰極緩沖液，依次加入樣品。
6.將電泳儀放入電泳槽中，倒入陽極緩沖液，用電泳儀連接正負極，恒壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恒壓3h左右待指示劑脫離凝膠下緣停止電泳。
7.凝膠的染色、脫色和保存方法與 SDS-PAGE 相同
。