本文是USP24細菌內毒素檢查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的譯文，但目前執行的標準是USP24版第二增補本（USP—NF19 Second Supplement）的細菌內毒素檢查法，讀者可對照學習，從中可看出USP24細菌內毒素檢查的不足之處。本文將介紹用鱟試劑檢測樣品內或樣品上存在的細菌內毒素濃度的方法。鱟試劑（Limulus Amebocyte,LAL）來自鱟的循環細胞，經水提取而行，制備和檢驗後，用於凝固法。
反應的終點是將供檢樣品稀釋後，與平行稀釋的參考內毒素標準進行直接比較得到的。測得的內毒素含量用規定的內毒素單位表示。
鱟試劑也是用濁度法或顯色法來讀取數據的，這些試齊只要能滿足這些選擇方法的要求，就可以使用。在做試驗時，需要先做出壹條標準曲線，並用該曲線計算供檢樣品的內毒素含量，包括樣品和對照液加鱟試劑後的培育時間和在分光光度計上讀取光密度時使用的波長等操作，都應該事先規定好。如果是終點濁度法，則到達培育期後，應立刻讀取讀數。而動力學檢測（兇手濁度法和顯色法），光密度的測定是貫穿於整個反應期間，而用於計算結果的百分數就是從這些讀數中計算出來的。在用終點法的顯色法檢測時，在到達事先規定的反應時間後，添加停止酶反應的試劑使反應停止後，再讀取數據。
1、參考內毒素標準與對照內毒素標準
參考內毒素標準（Reference standard endotoxin,RSE）是美國藥典（USP）的內毒素參考標準，其效價為每瓶10 000個USP內毒素單位（EU）。每瓶參考內毒素標準加5ml鱟試劑用水（LAL Reagent Watet），用旋轉攪拌器間歇攪拌30min使其溶解，制成原液，用這壹原液制作合適的系列稀釋。原液應保存於冰箱中，用於以後的稀釋，但保存時間不得超過14d。用前，用旋轉攪拌器強力攪拌至少3min，每壹步稀釋，至少攪拌30s，然後才能用它稀釋下壹步。經稀釋的參考內毒素不得貯存待以後使用，因為吸附作用會使其失去活性。對照內毒素標準（Contuol standard endotoxin,CSE）是以參考內毒素標準為標準另行制備的。壹批新的對照內毒素標準在使用前應進行檢定。檢定時使用的鱟試劑應為試驗中使用的同批鱟試劑。參考內毒素標準對照內毒素標準進行檢定時，可使用鱟試劑的凝固法，按“試驗操作”進行。每批對照內毒素標準，至少取1瓶與1瓶參考內毒素標準進行對比。參考內毒素標準的每個稀釋度作4管。每瓶或每個樣品的對照內毒素標準的每個稀釋度也都要4管。參考內毒素標準終點的對數Log10的平均值和對照內毒素標準終點的對數Log10平均值之間的差值的反對數等於對照內毒素標準效價的標定值。可根據情況，將其變換成每ng幹燥制劑的單位數或每瓶所含的單位數。
適宜的對照內毒素標準的效價應不小於2EU/ng也不大於50EU/ng。
2、試驗的準備
鱟試劑的靈敏度應經過確證。試驗中使用的所有容器和用具，都必須在≥250℃的烤箱中，用足夠的時間進行加熱處理、破壞這些用具表面上可能存在的外源性內毒素。
內毒素試驗的結果是否可靠，還必須從試驗使用的各種用具、溶液、洗滌用品中取樣或提取樣品，並用適當的方法證明它們對反應沒有抑制或拉強或其它幹擾作用。可按下述方法進行抑制試驗或增強試驗。試驗中應設置陰性對照。如果鱟試劑的原材料、生產方法或處方發生改變時都要重新進行試驗。
3、鱟試劑靈敏度的確認試驗
為了確認鱟試劑標簽上的靈敏度，每批至少取1瓶樣品進行檢定。參考內毒素標準（或對照內毒素標準）作2倍系列稀釋，稀釋成2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。其中λ是鱟試劑標簽上的靈敏度EU/ml。
上述4個稀釋度和陰性對照都要重復做4管。所得結果的幾何平均值的對數應大於或等於0.5λ，小於或等於2.0λ。每壹批新的鱟試劑，使用前都必須作標簽靈敏度的確認試驗。
4、抑制試驗和增強試驗
用不超過地大有效稀釋而檢測不出內毒素的樣品，不加或內毒素，使最後濃度等於2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。按照試驗操作（Test Procedure）項的規定用標準內毒素進行檢定。不加和加內毒素的樣品管至少做4管。同時，用水稀釋上述相同濃度的內毒素和陰性對照各兩管，做平行兩管試驗。按照計算和判定項的方法，計算樣品終點內毒素濃度的幾何平均值。
如果所得結果大於或等於0.5λ，小於或等於2.0λ,則該樣品適合作細菌內毒素檢查。
用中和、滅活或除去幹擾物質方法或用不超過最大有效稀釋度稀釋檢品後，可重做抑制試驗和增強試驗。如果用不超過最大有效稀釋法，對已知加量的內毒素可以克服抑制和增強作用。則樣品可以經過稀釋後，再作內毒素檢查。
如果在試驗條件下，對未處理的樣品檢查出有內源性內毒素。則該樣品不適合用於作抑制或拉強試驗。不過，這種樣品可用超過濾法將存在的內毒素去掉或做適當稀釋、使之適合於作抑制或增強試驗。稀釋未處理樣品（像開瓶溶解或在使用前註射前稀釋那樣），稀釋到檢驗不到內毒素但不超過最大有效稀釋倍數。再用這些已稀釋的樣品重作抑制試驗或增強試驗。
5、最大有效稀釋度（MVD）
最大有效稀釋度是指在使用時將藥物溶解或稀釋成恰好用於註射或其它非經口途徑使用的濃度。有時為了避免給藥量的體積（EU/ml）計算。用試劑標簽上的靈敏度（EU/ml）λ除限定濃度，就可以得到MVD因子。如果某壹試劑的限量濃度是按重量或按藥品的活性單位計算（EU/mg或EU/單位）。用限量乘藥品在溶液中的濃度，或按標簽說明稀釋成的濃度（mg/ml或單位/ml）,再除的λ，就可以得到MVD因子是準備試驗而使試驗有效的限定稀釋因子。
6、試驗操作
在準備和進行試驗的過程中，必須十分註意，避免使樣品受到大量的細菌汙染。為了定量檢測樣品中的內毒素含量，常用系列稀釋法稀釋樣品。用幾何稀釋法，使每上壹步稀釋較下壹步稀釋成為定比關系。試驗中應設陰性、陽性對照和陽性產品對照。
供試的每壹個樣品的每壹步系列稀釋，至少要做重復性2管。標準內毒素的系列稀釋應包括至少兩個重復管。每壹個框架的試管中都必須有壹組標準內毒素的系列稀釋管。只要每壹個框架的環境條件是均壹的，壹個框架中可以由幾個試管架組成。
（1）準備：標準內毒素以及鱟試劑的形狀與裝量，各個廠家不盡相同。因此，溶解和稀釋必須按標簽的說明進行。樣品和鱟試劑混合物的pH，除另有規定外，必須位於6.0—8.0之間。樣品的pH在試驗前，可添加滅菌的無內毒素汙染的氫氧化鈉、鹽酸或適宜的緩沖液調整。
（2）操作：取若幹10mm×75mm試管或單個的試驗管。每管加適量的陰性對照、標準內毒素、樣品和陽性產品對照。陽性產品對照由鱟試劑、洗液或提取液添加2.0λ濃度的標準內毒素置中，準確記錄試管的放置時間、於37℃±1℃，放置60min±2min,輕輕地取出觀察。形成結實的凝膠，翻轉180°，停留於原處不動者為陽性，記（+）號。不形成凝膠或形成的凝膠不結實，則判為陰性、記（-）號。拿取試管時，要輕拿輕放，避免不必要的碰撞，而出現假陰性結果。如果陽性產品對照呈陰性或內毒素標準的濃度不落在鱟試劑標簽靈敏度2倍稀釋的±1之間，或任何陰性對照出現陽性，試驗應判為無效。然後計算樣品中的內毒素含量。
7、計算和判定
（1）幾何平均值的計算：系列稀釋最後的陽性管為樣品或樣品加內毒素管的終點。記錄每管的終點濃度E，換算成對數終點濃度e，用下列公式計算終點的幾何平均濃度：
終點的幾何平均濃度=log-1(∑e/f)
其中∑e為各稀釋度對數終點之和；f為各稀釋度的重復管安數。
（2）內毒素含量計算：計算被檢樣品中或被檢樣品上的內毒素含量（EU/ml，EU/g或EU/mg）時，首先計算出終點濃度E，再乘以稀釋因子λ（λ為鱟試劑標簽註明的靈敏度）。被檢樣品的幾何平均濃度等於∑e/f的反對數，其中e等於終點濃度的對數，f為被檢樣品該稀釋度的重復管數。
（3）結果判定：如果內毒素含量小於該品種規定的含量界限，則該品種符合規定。