這裏的實驗基本操作技術是指在分子生物學實驗中使用範圍最廣、使用頻率最高、幾乎所有實驗都要應用的技術。器皿的清洗，試管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、電子天平等量具的正確操作和使用、試劑配制等技術，應當都是基本操作技術，但這些內容已在分析化學、生物化學的實驗課程中作了詳細介紹。本章主要介紹與分子生物學實驗有關的除（滅）菌技術、無菌操作技術和微量操作技術。
3.1 除(滅)菌技術
在進行分子生物學實驗過程中，需要壹個清潔的實驗環境，所使用的器皿及溶液均需要進行除（滅）菌處理，壹方面避免環境中微生物的汙染，另壹方面還可消除蛋白酶和核酸酶對實驗的幹擾和影響。在進行微生物及細胞的純培養時要求更高，不能有任何外來雜菌。因此，對所有器材、培養基要進行嚴格滅菌，對工作場所進行消毒，保證工作順利進行。
實驗室常用的除滅菌方法主要有物理方法及化學方法兩種。物理方法包括用濕熱（高壓蒸汽）、幹熱、紫外線、過濾、離心沈澱等方法除去微生物；化學方法是使用化學消毒劑、抗菌素等殺死或抑制微生物。根據被滅菌物品的材料性質和實驗要求，可采取不同的消毒滅菌方法。
3.1.1 物理滅菌法
（1）幹熱滅菌：幹熱滅菌包括火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。
火焰灼燒適用於金屬用具，如接種環、接種針和手術器械等，玻璃器皿的口頸，如試管口和瓶口，玻璃棒等的滅菌處理。這種方法滅菌迅速徹底。
熱空氣滅菌壹般在烤箱中進行，利用高溫幹燥空氣（160℃?170℃）加熱滅菌1?2h，適用於玻璃器皿和培養皿等。幹熱消毒後的器皿幹燥，易於保存。缺點是幹熱傳導慢，可能有冷空氣存留於烤箱內，因此要求較高的溫度和較長的時間才能達到消毒的目的。應當註意，幹烤滅菌完畢後不得馬上將烤箱門打開，須等溫度降至70℃以下時再開箱門，以免冷空氣突然進入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發生意外事故。在滅菌時，物品不能放的太擠。滅菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在幹熱滅菌時容易炸裂。培養基、橡膠制品、塑料制品不能用此方法消毒。
（2）濕熱滅菌：在相同溫度下，濕熱的滅菌效力比幹熱滅菌好。原因是：（1）熱蒸汽對細胞成分的破壞作用更強。水分子的存在有助於破壞維持蛋白質三維結構的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質變性。加熱使蛋白質變性，與水的含量有關，當環境和細胞含水量越大，凝固越快。蛋白質含水量與其凝固溫度成反比；（2）熱蒸汽比熱空氣穿透力強，能更有效地殺滅微生物；（3）蒸汽存在潛能，當氣體轉變成液體時可放出大量熱能，故可更迅速提高滅菌物體的溫度。
濕熱滅菌常用的方法有高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌和煮沸滅菌。其中高壓蒸汽滅菌法最為常用，效果最好。常壓蒸汽滅菌法不能在短時間內殺死細菌芽孢，必須采取間歇滅菌或持續滅菌的方法，才能達到完全滅菌。而煮沸滅菌僅用於註射器及某些用具的滅菌，被滅菌物品的濕度太大。所以，這兩種方法較少使用。
高壓蒸氣滅菌是在密閉的高壓蒸汽鍋中進行的。其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內，將鍋內的水加熱煮沸，並把其中原有的冷空氣徹底驅盡後將鍋密閉，再繼續加熱就會使鍋內的蒸汽壓逐漸上升，從而使溫度也隨之上升到100℃以上。
滅菌時，根據不同的物品選擇不同壓力和時間，壹般物品（如布類、金屬器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培養液和橡膠制品為0.1MPa下10min。滅菌前在鍋內加適量的水，加水過少，易將滅菌鍋燒幹，引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物品浸水。物品不能裝得過滿，以免影響消毒器內氣體流通。導氣管要伸至罐底並防止堵塞。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷空氣排出後，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，開始升壓，當達到所需壓力時，開始計時，並控制壓力恒定。滅菌過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止意外事件發生。滅菌完畢後壹定要先打開閥門放氣，當滅菌鍋內壓力下降到“0”時，再打開滅菌鍋的蓋。也可在滅菌完畢後，關閉電源總閥，讓滅菌物品自然冷卻，待滅菌鍋壓力表降至“0”時，再取出滅菌物品。
蒸汽壓力與溫度的關系
蒸汽壓力（表壓） 蒸汽溫度
Kg/cm2 MPa ℃ ℉
0.00 0.00 100 212
0.25 0.025 107.0 224
0.50 0.050 112.0 234
0.75 0.075 115.5 240
1.00 0.100 121.0 250
1.50 0.150 128.0 262
2.00 0.200 134.5 274
（3）紫外線殺菌： 紫外線的波長範圍是200?300nm，殺菌範圍為240?280nm，其中波長在260nm左右的紫外線殺菌作用最強。紫外燈是人工制造的低壓水銀燈，能輻射出257.3nm的紫外線，殺菌能力強且較穩定。紫外線殺菌作用是因為它可以被蛋白質（波長為280nm）和核酸（波長為260nm）吸收，造成這些分子的變性失活。紫外線穿透能力很差，不能穿透玻璃、衣物、紙張和大多數其他物體，但能穿透空氣，主要用於實驗室空氣、操作臺表面和不能使用其它方法進行滅菌的物品。紫外線直接照射方便、效果好，經壹定的時間照射後，可以消滅空氣中大部分細菌。培養室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒物品不宜相互遮擋，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外線照射可產生臭氧，汙染空氣，對試劑及培養液都有不良影響，對人皮膚也有傷害。
（4）過濾除菌：很多液體不能采用高壓滅菌的方法進行滅菌處理，如血清、合成培養液、酶及含有生物活性蛋白的液體等，可采用過濾的方法除去細菌等微生物。濾器有抽吸（抽濾）式及加壓式兩種類型；濾板（或濾膜）結構可分為石棉板、玻璃或微孔膜。常用的濾器有Zeiss濾器（蔡氏濾器）、玻璃濾器和微孔濾膜濾器，其中微孔濾膜濾器最為常用。
微孔濾膜濾器多為塑料結構，分為上下兩部分，中間可放置纖維素濾膜。將待過濾液體吸入註射器內，慢慢註入濾器上部的孔中，通過中間的濾膜即可。可用於包括血清在內的各種培養液的過濾除菌，速度快，效果好。濾膜為壹次性的特制混合纖維素濾膜，其孔徑有0.6μm、0.45μm、0.22μm三種，用於過濾除菌時，最好選用0.22μm的濾膜（可以除去細菌和黴菌）。安裝濾膜時要註意：先將濾膜在蒸餾水中浸濕再安裝；濾膜薄且光滑，容易移動，千萬不能裝偏而使過濾失敗；同時要註意濾膜的正反面，正面（光面）應朝上。由於濾膜薄，承受壓力有限，壓力不能過大、過猛，以免造成濾膜破裂。每次過濾後應打開濾器，核實濾膜是否移動和破裂，以保證有效過濾除菌。微孔濾膜濾器的清洗、消毒方法很簡單，用完後去掉濾膜，用去離子水沖洗幹凈，再將新的濾膜正確放入其中，包裹後可高壓滅菌處理，也可直接煮沸滅菌處理。現在也有壹次性小濾器。
3.1.2 化學滅菌法
應用化學制劑破壞細菌代謝機能。常用化學殺菌劑有：乙醇、醋酸、福爾馬林、高錳酸鉀、新潔爾滅等。最常見的是75%酒精及1‰的新潔爾滅，前者主要用於操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內的壁面處理。後者則主要用於器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學滅菌法操作簡單、方便有效。
將高錳酸鉀粉末與適量體積的福爾馬林混合，會產生大量的甲醛氣體，常用於無菌室的熏蒸消毒。
3.1.3抗生素滅菌法
主要用於培養用液滅菌或預防培養物汙染。要註意不能完全依賴抗生素來達到消毒滅菌的目的，還應嚴格無菌操作。常用的抗生素是青黴素和鏈黴素。
3.2無菌操作技術
無菌技術是指實驗過程中，防止壹切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區域不被汙染的操作技術和管理方法，是實驗過程中預防和控制交叉汙染的壹項重要基本操作。在生化實驗中經常涉及到無菌操作技術，尤其是微生物的純培養、細胞及胚胎的培養，更需要嚴格的無菌操作技術。在無菌操作過程中，任何壹個環節都不得違反操作原則，否則就可能造成實驗失敗。因此，必須加強無菌觀念，準確熟練地掌握無菌技術，嚴格遵守無菌操作規程。
無菌技術包括四部分內容：實驗所用的玻璃、塑料制品及金屬器械的處理；實驗操作對象及試劑的無菌處理；工作環境及表面的處理；實驗者的操作技術。前兩部分已在前面介紹過，這裏主要介紹後兩部分內容。
1. 周密計劃 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。
2．仔細準備 根據實驗要求，準備各種所需的器材和物品，並選擇適宜的方法進行包裝和除（滅）菌處理，清點無誤後將其放置操作場所(培養室、超凈工作臺)內。這樣可以避免開始實驗後因物品不全往返拿取而增加汙染機會。
3．嚴格操作
實驗進行前，無菌室及超凈工作臺以紫外燈照射30?60min滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作臺面，並開啟無菌操作臺風機運轉10min後，再開始實驗操作。實驗操作應在超凈工作臺的中央無菌區域，不要在邊緣的非無菌區域操作。
為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置於中央。
在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，並於開始操作前要用75％酒精擦手或用消毒液洗手。如果實驗過程中手觸及可能汙染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入細胞培養室需徹底洗手，戴口罩、著消毒衣帽及鞋等。
在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以後壹切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處並經過燒灼進行。但要註意：金屬器械不能在火焰中燒的時間過長，以防退火，燒過的金屬鑷要待冷卻後才能夾取組織，以免造成組織損傷。吸取過營養液後的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養液中。開啟、關閉長有細胞或微生物的培養瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細胞或微生物。另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞。進行無菌操作時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加汙染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備用品更換。
工作由始至終要保持壹定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養用液及其他溶液在未用前，不要過早開瓶；打開瓶蓋進行操作時，瓶口朝上與臺面呈45度角，減少落菌機會；用過之後如不再重復使用，應立即封閉瓶口。吸取營養液、PBS緩沖液、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防影響試劑的效果、擴大汙染或導致細胞交叉汙染。工作中不能面向操作臺講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發生汙染。手或相對較臟的物品不能經過開放的瓶口上方，瓶口最易汙染，加液時如吸管尖部碰到瓶口，則應更換幹凈吸管。
對於微生物或細胞而言，每次操作只處理壹種微生物或壹個細胞株，即使培養基相同也不要***享培養基，以免微生物或細胞間汙染。
4．善始善終 實驗完畢後，應及時將實驗物品及廢液帶出工作臺，關閉風機，以70%酒精擦拭無菌操作臺面，關閉超凈工作臺的風機和照明燈，實驗結束。盡管每次實驗前都會進行工作臺面的消毒處理，但建議實驗結束後立即打開紫外燈進行消毒，特別是在夏季，以防細菌或黴菌孳生。
無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其他實驗用品用完即取出，以利於空氣流通。
3.3微量操作技術
在過去的實驗中，大家使用的重量和體積計量單位主要是克（g）和毫升（ml）及其以上者，而小於g和ml的單位如毫克（mg）、微克（?g）及微升（?l）等極少用到。從進入分子生物學實驗開始，這些很小的計量單位都將經常使用，甚至更小者如納克（ng）、皮克（pg）及納升（nl）等也將用到。由相對宏觀的操作突然轉為微量操作，對初學者來講需要有壹個熟悉並熟練的過程，關鍵應當註意以下幾個方面的問題。
1. 熟悉並掌握微量稱量器具的正確使用方法。微量電子天平（最小感量10-4g）和微量移液器（最大2?l）是兩種最常使用的器具，它們的使用方法請參考第2章有關內容。準確量取是微量操作的第壹步，也是最重要的壹步。
2. 添加。將壹種或幾種液體物質分別準確量取後添加到同壹個Eppendorf管中，必須保證看到每壹種液體都加入其中，而且在取出移液器時，Tip頭的尖部不得帶出任何可見的液珠。
3. 混勻並集中。全部液體加完後，總體積只有10到幾十微升，難以用常規混勻的方法將各種成分徹底混勻。微量混勻的方法有：旋渦震蕩混勻和彈勻。將盛有液體的Eppendorf管蓋緊，握緊並將其底部與旋渦震蕩器接觸，液體會在管內高速旋轉而混勻；也可手持蓋好的Eppendorf管上端（口部），另壹只手反復彈動其底部，將其中的液體混勻。最後，用高速臺式離心機將全部液體甩到Eppendorf管的底部。
4. 有時將極微量的物質如DNA片段或質粒DNA溶解在幾微升液體中，盡管看不見待溶解物質，但將液體加入後，用上述同樣的方法進行操作，也可很好將其溶解並混勻。
5. 由於微量操作，實驗結果很難用肉眼直接觀察到。為了保證實驗的順利進行，在分子生物學實驗過程中，每壹步實驗的結果都必須利用相關的檢測、鑒定方法顯示出來，判定正確後再進行下壹步反應。這是所有科學實驗的***同要求，但在分子生物學實驗中更應當強調和加以註意。
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