普拉茨生物學
來自生物醫學研究專欄
我想研究分子海綿，但是為什麽雙熒光素酶的結果總是陰性？
-get ncRNA，需要額外註意這些技術問題！
三種非編碼RNA(ncRNA)，miRNA/lncRNA/circRNA，仍然是基礎醫學研究領域最熱門的研究熱點。項目初期，大多數研究人員通過查閱文獻或二代測序+生物信息學分析獲得合適的研究對象，但在實驗推廣過程中遇到了很多困難。有幾個主要原因:
1.錯誤的成績單；
2.NC RNA的過表達和幹擾，尤其是lncRNA/circRNA幹擾，很難成功實現；
3.內源性競爭RNA的靶關系檢測和雙熒光素酶檢測很難獲得陽性互補配對結果；
4.NCRNA對裸鼠皮下腫瘤的作用通常是無效的。
如何避免這些常見問題？
今天我們來談談為什麽lncRNA/miRNA或circRNA/miRNA的雙熒光素酶檢測結果往往是陰性。
雙熒光素酶陰性
首先，這種檢測技術非常適合miRNA-mRNA靶向結合位點的驗證。然而，令人苦惱的是，lncRNA/miRNA或circRNA/miRNA的檢測往往是陰性的。
主要原因是:
(1)生物信息學預測的潛在結合位點單壹。通常，壹個miRNA會靶向多個靶基因，或者與lncRNA/circRNA存在多個結合位點。同時，由於各個預測數據庫的算法不同，多數據庫交叉預測是必要的。
(2)所選的lncRNA和circRNA不具有分子海綿的功能。
比如lncRNA在細胞核中表達而不在細胞質中表達，在細胞核中表達的lncRNA不能作為分子海綿吸附miRNAs。或者不與AGO2蛋白結合(AGO2是lncRNA/circRNA起海綿作用的指示蛋白，分別與吸附的miRNA形成CircRNA/LNC RNA-miRNA-Ago2蛋白的三元復合物)。
因此，在檢測lncRNA/circRNA-miRNA雙熒光素酶之前，需要做以下工作:
1) RIP-QCPR:檢測lncRNA/circRNA是否與AGO2蛋白結合。
2) RNA下拉:對上述lncRNA/circRNA進行RNA下拉實驗，用定量PCR檢測被拉的RNA，看是否有預測的miRNAs。
3) FISH:檢查lncRNA/circRNA和miRNA的表達是否存在* * *定位。
4)熒光素酶測定:分別構建含有與miRNA結合的lncRNA/circRNA位點區域的熒光素酶載體和具有miRNA結合位點突變的熒光素酶載體。
如果前期制作lncRNA/circRNA-seq，可以同時制作AGO2 RIP-seq，這樣交匯處的lncRNA/circRNA既有差異表達，又有可能起到分子海綿的作用。
風險警告:
1.由於雙熒光素酶載體表達的circRNA序列不能成環，所以在檢測circRNA與miRNA的靶向關系時不能完全模擬細胞內環境，還需要其他實驗來證明。
2.lncRNA和circRNA壹般都有相對復雜的二級結構，RNA復雜的二級結構可能會阻止與miRNA的相互作用，所以陽性檢測結果不壹定能完全解釋細胞內環境相同的情況，還需要* * *定位和pull down等其他實驗來證明這壹結論。
LncRNA/circRNA-seq和AGO2 RIP-seq也可以在測序前期同時進行，這樣重疊部分的結果就是可能起到海綿作用的LncRNA/circRNA。