酵母整合表達壹般整合在哪裏？

當傳統的大腸桿菌表達系統被頻繁用於研究各種基因的表達時，壹種新的有效的基因表達系統——甲醇酵母正逐漸引起人們的關註。該系統不僅具有高表達、高穩定、高分泌的特點，而且其宿主甲醇酵母畢赤酵母具有高密度生長的特點。因此，近年來對該表達系統的研究發展迅速，許多具有商業價值的外源蛋白在其中得到了表達。本文簡要綜述了甲醇酵母基因表達系統的特點和研究進展。甲醇酵母1表達系統的特點1.1宿主巴斯德畢赤酵母於20世紀70年代用於生產單細胞蛋白(SCP)，具有良好的發酵基礎，細胞密度可達100g/L幹重。其生長培養基的成分包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉價無毒。能在以甲醇為唯壹碳源的培養基中快速生長，甲醇代謝途徑的關鍵酶醇氧化酶AOX可達細胞可溶性蛋白的30%[1]。然而，在以葡萄糖、甘油或乙醇為碳源的培養細胞中不能檢測到AOX。AOX的合成在轉錄水平受到調控。其基因啟動子具有明顯的調控功能，可用於調控外源基因的表達。這種調節受壹般碳源抑制/去抑制和特殊碳源誘導和再強調機制控制。外源基因在甲醇以外的碳源中不表達，但在培養基中加入甲醇後，外源基因被誘導表達。畢赤酵母中有壹種叫做微粒體的細胞器，在這種細胞器中大量合成過氧化物酶，所以也叫過氧化物酶體。合成的蛋白質可以保存在微粒體中，微粒體可以保護蛋白質不被蛋白酶降解，不會對細胞造成毒性。1.2載體畢赤酵母的載體是整合載體。常見的表達載體有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。圖1是典型的巴斯德畢赤酵母表達載體。該載體含有醇氧化酶-1 (AOX 1)的啟動子和轉錄終止子(5’AOX 1和3’AOX 1)，它們被多個克隆位點(MCS)分開，在這些位點可以插入外源基因。該載體還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記和3’AOX 1區域。整合載體轉化受體時，其5’AOX 1和3’AOX 1可與染色體上的同源基因重組，使整個載體和外源基因插入受體染色體，外源基因在5’AOX 1啟動子的控制下表達。1.3表達菌株的構建類似於釀酒酵母基因工程表達系統的建立，構建畢赤酵母表達菌株的基本方法如下:(1)經典的遺傳操作方法(如突變體分離、互補分析、回交和單孢子分析)；(2)分子遺傳學方法(如DNA轉化和基因置換)。[3])為了獲得高度穩定的外源蛋白表達菌株，通過同源重組將畢赤酵母表達載體和外源基因整合到宿主染色體的基因組座位中。對於圖1所示的表達載體pPIC3，可以通過兩種方式整合到染色體中。壹種是在His4或5’AOX 1 DNA片段的單壹限制性位點將質粒載體切割成線性，並通過單壹交換將其整合到染色體中(圖2A和b)。另壹類質粒載體用Bgl酶切，釋放出含有AOX1末端序列的表達盒，與宿主染色體上的AOX1基因進行壹步基因置換(圖2C)。通過這種方式獲得的表達菌株是AOX1缺陷型，其甲醇代謝速率明顯減慢，但有時外源蛋白表達水平遠高於野生型菌株，尤其是在搖瓶培養中。與自我復制型質粒表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數可以變化很大。含有多拷貝外源基因的表達菌株也合成了更多的蛋白質。有兩種方法可以獲得多拷貝表達菌株。壹種是通過SDS-PAGE電泳[6]、免疫雜交[7]或菌落點雜交自然篩選大量轉化子。獲得了高產的表達菌株。另壹種是在轉化前將多個表達盒拷貝插入單個載體[8]，然後通過交換整合到受體染色體中。這兩種方法獲得的多拷貝表達菌株在發酵罐培養的產物選擇壓力下被證明是穩定的。畢赤酵母表達菌株1.4的生長用同壹表達載體轉化後分離出不同的轉化子，其產物的表達水平不同。即使相同數量的表達盒在受體染色體上重組。轉化子的表達也不同。因此，為了獲得高產表達菌株，需要篩選大量的轉化子。小型搖瓶培養無疑是壹種簡單有效的篩選轉化子的方法。然而，畢赤酵母在搖瓶培養中表達的外源蛋白水平往往不能準確反映在罐發酵中的表達，這使其很頭疼。主要原因是在搖瓶培養中，培養液的pH值無法控制，培養通風不充分，最佳碳源添加速率無法控制。但是，為了避免對每個表達菌株進行發酵條件的繁瑣實驗，仍然需要探索表達菌株在搖瓶中的培養條件，使其產物的表達量接近預期的發酵結果。畢赤酵母表達菌株的培養條件包括:適宜的培養基緩沖體系和適宜的發酵培養基pH值以降低蛋白酶活性；最大通風；添加適量的蛋白腖或酪蛋白水解物，防止產品被蛋白酶降解，並為外源蛋白的合成和分泌提供氨基酸和能量。在以甘油為碳源的培養基中，細胞生長迅速，細胞密度逐漸增加，但此時外源基因的表達被完全抑制。然而，當甘油缺失或完全消耗時，向培養基中加入甲醇以誘導外源蛋白的產生。這個階段菌群生長緩慢，但產品表達旺盛。通過研究人員的努力，已經成功報道了生產外源蛋白的各種畢赤酵母的分批和連續培養。1.5分泌外源蛋白畢赤酵母表達外源蛋白有兩種方式:胞內表達和胞外分泌。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，外源蛋白的分泌需要信號序列來指導分泌。當然，使用外源蛋白本身的信號序列是方便的，因為基因的所有編碼序列都可以插入到表達載體的單個或多個克隆位點中。但在很多實驗中，畢赤酵母並不能利用外源基因本身的信號序列來指導分泌。而由89個氨基酸組成的釀酒酵母分泌信號-α交配因子指導序列，成功指導了幾種外源蛋白的分泌，如小鼠表皮生長因子，產量為0.45g/L[11]。2外源蛋白在畢赤酵母中的表達隨著畢赤酵母表達系統的不斷發展和完善，許多具有商業價值的外源蛋白已在該系統中成功表達。由於其表達載體上有醇氧化酶基因的強啟動子，外源蛋白的表達量很高，如破傷風毒素蛋白的產量為12g/L，外源蛋白在畢赤酵母中的表達分為胞內表達和胞外分泌兩種方式。我們將總結外源蛋白在畢赤酵母中的表達，如表1所示。國內對畢赤酵母表達外源蛋白的研究近幾年才剛剛起步。國家海洋局第三海洋研究所陳丹等人[12]在該酵母中表達了鱸魚生長激素，表達量為100mg/L/L，目前美國Invitrogen公司已有表達系統試劑盒出售，利用該系統表達外源基因非常方便。在國內外實驗室的共同努力下，利用畢赤酵母基因表達系統將生產出具有商業價值的外源蛋白。參考文獻[1] Couderc，r .等人。化學1980，44: 2279-2289。[2] Tschopp，J. F .等人,《核酸》, 1987，66。j . m . et al . bio/Technology 1993，11:905-910。[4]Tschopp，J.F.etal.Bio/Technology，1987，5:1305-1308。[5]J.M.etal.Bio/Technology,1987,5:479-485.克萊格[6]Sreekrishna，K，等。生物化學，1989，28:4117-4125。[7]克萊爾。J.etal.Bio/Technology,1991,9:455-460.[8]韋德維克，T.etal.J.Ind.Microbiol，1991，7:197-201。[9]Romanos，M.A .等人，疫苗，1991，9:901-906。甘地，M.E.etal.Bio/Technology，1989，7: 160-164。[11]克萊爾，J.J .等人基因，1991，105: 205-265438。25(2):140-143.(哈爾濱應用微生物研究所，150010)抽象甲基營養酵母異源基因表達系統已被利用來降低吸收水平。ithasalotofadvangagesaexpressionhostsforseeexistence of well-established發酵方法和代表民族調節的前體。在本綜述中，介紹和討論了系統的基本特征和應用