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臨床微生物檢驗的快速診斷技術研究進展
關鍵詞：分子生物學來源：《CHKD》雜誌《當代文庫》：CHKD期刊全文《當代醫學文庫》2099年第16期
（本文作者：中國人民解放軍第二五二醫院李素麗）
目前，傳染病仍是危害人類健康的主要疾病。隨著新發和暴發傳染病的出現，曾經得到控制的傳染病又死灰復燃，引起傳染病的微生物日趨復雜，常見病原微生物出現大量耐藥菌株，加之新病原微生物的出現，給臨床診治帶來了很大的困擾。嚴峻的現實對病原微生物的檢測和診斷提出了更高的要求。世界衛生組織（WHO）對臨床微生物實驗室提出：臨床微生物實驗室應盡可能以快速診斷為主。利用壹切手段將實驗室數據轉化為對臨床有用的信息。
1自動化鑒定技術的應用
臨床微生物的實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，尤其是分離培養，仍是許多病原體檢測的 "金標準"。但細菌的生長繁殖需要壹定的時間，檢測周期難以縮短。此外，許多病原體的培養受營養要求、抗生素應用和病原體含量等因素的影響。傳統的人工方法操作復雜，檢測周期長，靈敏度和特異性有限。為了解決這壹問題，各種自動化培養和鑒定系統應運而生，隨著計算機的發展和應用，出現了壹些自動和半自動的細菌鑒定和藥敏系統，統稱為 "微生物鑒定專家系統"，這些系統大大提高了臨床實驗室的工作效率和檢測的準確性，傳統的鑒定 這些系統大大提高了臨床實驗室的工作效率和準確性，傳統的鑒定方法在壹定程度上得到了逐步改進和加速。
2免疫學方法
免疫學技術利用特異性抗原-抗體反應來檢測病原微生物，簡化了病原微生物的鑒定，備受關註。各大文獻數據庫提供的數據顯示，幾乎所有病原體的血清學檢測方法都已建立，這表明該方法已成為微生物實驗室常用且成熟的檢測技術。
2.1 凝集技術 常用的凝集技術有乳膠凝集法和血清凝集法。用於微生物的初步診斷、分型和鑒定，如霍亂弧菌和誌賀氏菌、大腸桿菌 O.57:H7、腦膜炎球菌等的分型，可在短時間內完成鑒定。該診斷方法具有操作簡便、快速、準確、特異性強、陽性率高等特點。
2.2 熒光抗體技術 熒光抗體技術是基於抗原抗體反應具有高度特異性，以熒光素作為抗原標記物，在熒光顯微鏡下檢查特異性抗原抗體復合物的熒光及其存在情況。熒光抗體技術的主要特點是特異性強、速度快。呂誌林等報道了美國同行用炭疽桿菌細胞壁（CW-DFA）和莢膜抗原（CAP-DFA）特異性熒光標記的單克隆抗體，可快速鑒定炭疽桿菌。
2.3酶聯免疫法 酶聯免疫法目前已廣泛應用於多種病原微生物的檢測，既可檢測樣品中的病原抗原，也可檢測生物體內的抗體成分。Gehring 等人使用酶聯免疫化學發光法（ELIMCL）測定大腸桿菌 O.57：H7，成功地從病人的咽拭子標本中同時檢測出可能的肺炎支原體、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。許多疾病已在商業試劑盒中進行了檢測。許多疾病的檢測試劑盒已經商業化。
3分子生物學技術
隨著分子生物學技術的飛速發展，人們對微生物的認識從外在表型逐漸轉向微生物內部基因結構特征，微生物檢測從生化、免疫學方法轉向基因水平檢測，對於那些難以培養和不可能培養的微生物，可以直接通過獲取基因信息，為微生物檢測帶來了新的領域。這給微生物檢測帶來了新的領域，為科學的快速發展提供了新的契機。
3.1 PCR技術 PCR具有高度的靈敏性和特異性，在檢測病原體時，對形態和生化反應不典型的微生物進行鑒定，常規方法往往難以準確檢測，即使有大量死菌PCR也能做出準確鑒定；不受混合標本的影響，可以很容易地從大量正常菌群標本中鑒定出病原菌；適用於生長緩慢或難以培養的微生物鑒定，如分枝桿菌。對於生長緩慢或難以培養的微生物的鑒定，如分枝桿菌、幽門螺桿菌、支原體、衣原體、螺旋桿菌等，其他方法的陽性檢出率很低，而 PCR 技術對於這類菌株的鑒定具有重要意義。
但傳統的PCR技術也存在壹些問題，如假陽性、引物二聚體的形成、檢測操作也比較繁瑣、中間汙染環節多等，容易出現假陽性或假陰性結果。為了克服這些缺點，壹些新的PCR技術逐漸衍生出來並應用於實踐，如嵌套PCR、反轉錄PCR、多重PCR、通用引物PCR（UP-PCR）、PCR單鏈構象多態性分析、隨機引物DNA多態性擴增（RAPD）、限制性長度多態性分析（RFLP）、實時熒光定量PCR等。
3.2 基於 16S rRNA 和 GyaB 的檢測技術
3.2.1 以 16S rRNA 為目標基因的檢測 16S rRNA 存在於所有原核細胞中，相對穩定，拷貝數較高，其序列包含可變和高度保守的區域，因此可以設計出群、屬、種特異性的探針。現階段，幾乎所有常見細菌的 16S rRNA 基因都已測序，16SrRNA 編碼基因的這些特點使其成為細菌基因分類的理想目標序列，並逐漸成為細菌鑒定和分類的 "金標準"。
3.2.2回旋酶（g yras e）B亞基基因靶基因的檢測 16S rRNA除了具有上述優點外，其基因進化速度高於核糖體基因，GyaB在幾乎所有細菌中都是單拷貝形式。研究表明，基於 GyaB 序列構建的進化圖與基於 DNA-DNA 雜交的進化圖是壹致的。Fukushima 等人以 GyaB 基因為靶基因，設計了壹種檢測分枝桿菌屬的基因芯片，實驗結果表明，這種芯片能在物種水平上鑒定分枝桿菌屬，並能區分近緣菌株，這對臨床治療具有重要的參考價值，表明分析 GyaB 的序列是壹種在物種水平上鑒定細菌的快速有效的方法。這表明分析 GyaB 基因序列是壹種快速有效的物種水平細菌鑒定方法。
3.3 多焦點序列分型法 多焦點序列分型法（MLST）是近年來發展迅速的分子生物學方法，具有很高的鑒別力，適用於分子流行病學和分子進化研究。MLST 越來越多地被用作進行國際菌株比較、建立更精確的分析系統、研究不同抗生素耐藥菌株的出現、對相關特定基因型和新突變體引起的疾病進行流行病學分析以及研究種群結構的工具。
3.4 環介導等溫擴增（LAMP） 環介導等溫擴增（LAMP）是近年來發展起來的壹種靈敏、特異、方便、快速的核酸擴增技術。與傳統方法相比，它不需要熱循環進行等溫擴增，而且由於反應中產生大量副產物--白色焦磷酸鎂沈澱，擴增產物無需電泳即可通過肉眼觀察或濁度計判斷。因此，LAMP 是壹種特異性高、靈敏度高的 DNA 擴增方法，無需熱循環儀，肉眼即可判斷結果。針對目標基因的六個區域設計了四種特異性引物，使用鏈置換聚合酶在恒溫（約 65°C）下約 60 分鐘即可完成核酸擴增反應，產生特征性的梯形條帶。LAMP技術可用於病原微生物的現場快速檢測、戰時現場和基層推廣應用。
4分子生物傳感器
分子生物傳感器是新興傳感器技術與分子診斷技術相結合的新技術，是現代臨床診斷發展的新方向。由於生物傳感器檢測準確、操作簡便等特點，近年來在許多領域取得了長足進步，在傳染病診斷、藥物篩選、未來戰爭生物戰劑監測等領域得到了廣泛應用，其中用於病原體檢測的DNA生物傳感器在臨床上最為常見。我國科學家陳建柱最新制成的生物傳感器，僅用20s的時間就能檢測出微量SARS病毒、天花病毒和炭疽桿菌的存在，從而達到早期診斷的目的。
5基因芯片
基因芯片是壹種高通量群體指標分析系統。基因芯片技術是壹項嶄新的技術，被稱為基因功能研究領域最偉大的發明之壹，具有壹次檢測數萬個基因的優勢。它以多個特異性寡核苷酸片段或基因片段為探針，有規律地排列固定在矽、玻璃、尼龍膜等固相介質上，形成生物分子陣列，從而達到壹次檢測同時檢測多種疾病或樣本的目的。基於基因芯片的高通量、微型化和並行分析等特點，基因芯片在微生物病原體檢測、物種鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測和基因組監測等研究領域發揮著越來越重要的作用。目前，許多細菌、病毒等病原體的基因組測序工作已經完成，許多代表各種微生物的特殊基因裝入芯片後，通過反轉錄可以檢測樣本中有無病原體基因的表達和表達水平，從而判斷患者感染的病原體、感染過程以及宿主反應等，大大提高了檢測效率。
6 蛋白質指紋圖譜
蛋白質指紋圖譜是隨著蛋白質組學的發展而興起的壹項新技術。近年來，越來越多的學者意識到從蛋白質水平研究微生物的必要性。1996 年，Clayin 等人利用 MALDITOF MS 成功鑒定了革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，指出不同屬的細菌具有不同的蛋白質指紋，而同種細菌具有相似的蛋白質指紋。同種細菌的蛋白質指紋相似，根據蛋白質指紋可以快速識別細菌。中國科學院微生物研究所唐紅研究員等利用最新的 "蛋白質質譜指紋圖譜 "技術及其檢測方法，可以分析出 SARS 病人和非 SARS 病人血清中蛋白質成分的變化。這種檢測 SARS 病毒的方法經北京天壇醫院臨床證實，陽性率近 95%，特異性近 96%，在病人發熱的第壹天就能得出滿意的結果。有專家稱，蛋白質指紋圖譜技術標誌著壹種劃時代診斷模式的誕生。
隨著計算機技術的不斷發展，臨床病原體檢測將向高度自動化和簡便快速檢測技術兩個方向發展。分子生物學技術通過自動化儀器的使用，將在病原菌的診斷、鑒定和耐藥基因檢測中發揮巨大作用。隨著多學科交叉時代的到來，最終將徹底改變臨床病原菌檢測的現狀和傳統觀念，實現高效、優質、快速、統壹。