蛋白質標簽按其功能大致可分為三類:檢測標簽、表達純化標簽和示蹤標簽。
蛋白質的檢測方法有質譜法、酶活性檢測法和免疫分析法，其中免疫分析法應用最為廣泛，常用的方法有WB(Western Blot)、ELISA(酶聯免疫吸附法)和IP(免疫沈澱法)。免疫分析需要將目的蛋白作為抗原註射到動物體內，然後從免疫血清中分離出抗體，根據抗原與抗體的免疫反應進行特異性檢測。這種方法最大的缺點是每次更換壹個目的蛋白，都要制備相應的抗體，繁瑣且昂貴。融合標簽的使用使得蛋白質免疫分析通用且方便。當我們將壹個特定的標簽與目標蛋白融合後，兩者被共同表達。通過檢測融合標簽，我們可以得到目的蛋白的表達。經過長期的研究，已經開發出壹些成熟的檢測標簽。以下是壹些介紹:
1)公頃
HA標簽是含有***9個氨基酸的小標簽，標簽序列YPYDVPDYA來源於流感病毒血凝素的表面抗原決定簇，對目的蛋白的空間結構影響很小，可以融合到N端或C端，因此可以購買用於商業化的抗HA抗體檢測。HA標簽通常用於蛋白質印跡、免疫熒光和免疫沈澱實驗，偶爾用於ELISA和芯片分析。
2)他的
他的標簽，也是小標簽，指的是六個組氨酸多肽。這種標簽對目標蛋白的空間結構影響很小，可以融合到N端或C端。壹般不需要去除，也不會影響目的蛋白的功能。商業抗His抗體檢測可以購買。他的標簽經常用於蛋白質印跡實驗。
3) c-Myc
Myc標簽含有人原癌基因Myc的10個氨基酸片段，序列為EQKLISEEDL，可融合於目的蛋白的N端或C端。由於可以獲得高特異性的抗Myc單克隆抗體，因此廣泛用於蛋白質印跡、免疫熒光和免疫沈澱實驗，但很少用於蛋白質純化。目前，市場上有許多商品化的c-Myc抗體。
4)標誌，3×標誌
FLAG標簽是目的蛋白中流行的短肽標簽，其序列為DYKDDDDK，可與蛋白的C端或N端融合。因為它含有腸激酶的識別位點(DDDDK)，可以很容易的去除，所以更適合融合到目的蛋白的N端。Flag標簽比類似的標簽更親水，所以它們通常不會使附著在它們上面的蛋白質變性或失活，並且經常用於檢測真核表達系統中的目標蛋白質。目前已開發出較好的22個氨基酸、分子量為2.7KDa的3×Flag標簽。3×Flag的標記序列不唯壹。有些文獻直接用三個標誌串聯重復標簽，不利於標簽的去除。常用的序列是DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。3×Flag的免疫原性和親和力大大增強，適用於真核生物中低水平表達蛋白的檢測和純化。目前市場上有很多市售的Flag和3×Flag抗體。
5) S
s標簽是來源於胰腺核糖核酸酶A(RNase A)N端的短肽，其氨基酸序列為KETAAAKFERQHMDS。S標簽通常構建在目的蛋白的N端或C端，商品化的S標簽抗體可用於免疫分析。此外，S-tag與S-蛋白(也來自RNase A)之間有很強的相互作用，因此S-tag可用於蛋白純化。但由於洗脫條件苛刻，為了獲得功能蛋白，建議用蛋白酶切割標簽，然後洗脫目標蛋白。
6) T7
T7標簽，來源於T7噬菌體衣殼蛋白的表位標簽，序列為MASMTGGQQMG，可融合於目的蛋白的N或C端，可購買用於商品化的抗T7抗體檢測。T7標簽常用於蛋白質印跡實驗。
7) V5
V5標簽是存在於猿猴病毒5型(SV5)副粘病毒的P和V蛋白中的小表位(Pk)短肽，其序列為RNA聚合酶α亞基的95-108氨基酸殘基，可融合於目的蛋白的N或C端。在文獻中，V5主要融合於靶蛋白的C端，常用於哺乳動物和昆蟲細胞表達系統的蛋白印跡、免疫熒光和免疫沈澱檢測。
純化蛋白質的方法有很多，如離子交換、疏水層析、分子篩和親和層析等，其中親和層析無疑是最好的壹種，它利用基質與蛋白質標記物之間的特異性結合來獲得高產量、高純度的目的蛋白。下面就來介紹幾個常用的凈化標簽。
1)他的
His標簽，多指由六個組氨酸組成的融合標簽，即His6，可以融合到目的蛋白的C端或N端。他的標簽是蛋白質純化領域的“最美”。在1987中，Hochuli等人首次提出用組氨酸標簽純化蛋白質，他的標簽至今仍是蛋白質純化領域中應用最廣泛的標簽。組氨酸殘基的側鏈與固定化鎳離子有很強的吸引力，可用於固定化金屬螯合色譜(IMAC)。標簽的分子量較小，只有0.84KD左右，壹般不影響目的蛋白的功能。此外，His標簽還可以用於免疫分析，而與His標簽融合的蛋白免疫原性低，因此純化後的蛋白可以直接註射到動物體內進行免疫，制備抗體。
2)商品及服務稅
GST(谷胱甘肽硫轉移酶)標簽是蛋白質純化中最常用的標簽之壹。GST是壹個大標簽，是壹個完整的蛋白質，分子量約26KD。壹方面，GST具有很高的溶解性，可以增加目的蛋白的溶解度；另壹方面可以在大腸桿菌中大量表達，提高目的蛋白的表達。因此，它被廣泛用於各種融合蛋白的表達，並可在宿主細胞如大腸桿菌和酵母中表達。GST標簽融合蛋白可通過含還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的親和樹脂直接從細菌裂解液中純化，用10mM的還原型谷胱甘肽洗脫，獲得高濃度、高純度的融合蛋白。但由於GST標簽較大，通常需要去除標簽，所以GST壹般融合在靶標的N端。對於目標蛋白是活性酶的情況，如果活性驗證後GST對酶的活性沒有影響，也可以保留標簽。目前，也有許多商業化的GST抗體可用於目標蛋白的特異性檢測。
3) MBP
MBP(麥芽糖結合蛋白)標簽是蛋白質純化中最常用的標簽之壹，也是壹種大標簽。其分子量超過40kDa，由大腸桿菌K12的雄性基因編碼。MBP可以增加目的蛋白在細菌中的溶解度，尤其是真核蛋白，還可以增加融合蛋白的表達。MBP可與交聯澱粉親和樹脂結合，結合後的融合蛋白可在溫和條件下用10-20mM麥芽糖洗脫，獲得高純度、高濃度的目的蛋白。MBP的特性和用法與GST非常相似，也有專門的商用抗體進行檢測。應該註意的是，MBP序列有兩種形式。壹種是N端含有信號肽，適合表達和純化毒性蛋白，壹般融合在N端；無信號肽的序列，可在N端或C端融合，多在N端融合。
4)中央商務區
CBD標簽，通常指來自枯草芽孢桿菌的幾丁質結合域，具有大約5kDa的分子量。該標簽由NEB Company引入，並結合其Impact(旨在用親和幾丁質結合標簽純化)系統用於(毒性)靶蛋白的表達和純化。在IMPACT系統中，CBD和來自酵母的內含肽蛋白形成雙效融合標記。內含子是蛋白質剪接元件，類似於基因組中的內含子。內含肽在低溫和還原條件下經歷自身介導的N-末端切割，這可以釋放連接的靶蛋白。也就是說，融合表達產物掛在親和層析柱上後，只需在低溫(4℃)下用含DTT、巰基乙醇或半胱氨酸的溶液洗脫，即可洗脫出目的蛋白，而融合標記則留在純化柱上，可以非常簡單地去除還原劑的小分子。後來NEB又推出了IMPACT-CN系統(即融合標簽可以選擇在目的蛋白的C端或N端)和更靈活方便的IMPACT—TWIN系統。有興趣的可以自己了解壹下。
(我用過這個系統，但是效果沒有宣傳的那麽理想，原因有兩個:1)因為DTT是作為切割體使用的，所以不適合含有內部二硫鍵的蛋白質的純化。2)融合基因在體外和體內有很大的自剪切風險，在純化高毒性的蛋白時很難獲得目的蛋白。)
5)鏈球菌標記
Strep tag，壹般稱為Strep-tag II，是壹種長度為8個氨基酸的短肽，序列為WSHPQFEK，可以融合到目的蛋白的N端或C端。Strep tag融合蛋白在鏈黴菌抗生物素蛋白柱上與基質特異性結合，D-生物素或其衍生物可作為洗脫劑，從而實現融合蛋白的特異性純化。因為抗體柱非常昂貴，所以在蛋白質純化中不常用鏈黴標記。
6)光環標簽
Halo tag是細菌脫鹵酶的遺傳修飾衍生物，可與各種人工合成的分子量為33KDa的Halo-Tag配體有效結合，可融合到重組蛋白的N端或C端，並在原核和真核系統中表達。
7)咬合標記
SNAP- tag是人O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的突變體，長度為182個氨基酸，分子量約為19 kDa，可與任何目的蛋白融合，並可進壹步用合適的配體(如熒光染料)進行特異性標記。當純化或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定有苯鳥嘌呤的底物混合時，該蛋白可以特異性地與底物相互作用形成價鍵，融合蛋白間接固定在底物表面，可以更方便快捷地達到研究蛋白質功能或純化蛋白質的目的。SNAP-Tag是新壹代的蛋白質標記技術，不僅特異性高，而且穩定。其最大的優點是適用於各種環境中蛋白質的檢測和純化，如活細胞、溶液或固相(如SDS-PAGELS)。
8)相撲
SUMO tag是壹種小的泛素樣修飾物，在壹級結構上與泛素只有18%的同源性，但它們的三級結構和生物學功能非常相似。發現SUMO可以作為融合標記，不僅可以提高融合蛋白的表達，還具有抗蛋白酶水解、促進目的蛋白正確折疊、提高重組蛋白溶解性的作用。此外，SUMO蛋白水解酶的使用可以識別完整的SUMO標簽並有效地從融合蛋白中切割SUMO。該標簽主要用於提高目的蛋白的表達，並不是常見的純化標簽。為了用於純化，可以使用雙標記。
9) NusA、TrxA、DsbA
NusA標簽是壹種逆轉錄終止因子，可以增加融合蛋白的溶解性和表達量。TrxA標簽是硫氧還蛋白，幾乎存在於所有生物體內。它不僅可以增加融合蛋白的溶解性，還可以促進細菌周質提取物的純化，幫助外源基因形成二硫鍵。DsbA標記是蛋白質二硫鍵異構酶，可以增加目的蛋白的溶解性，有助於形成二硫鍵。
這三種標簽主要用於提高目的蛋白的表達，本身並不用於純化。只有當它們與另壹個親和標簽結合時，蛋白質才能被純化。而且這三種標簽都具有胞質周定位的功能，所以壹般都融合在目的蛋白的N端。這三個是大標簽，可能會影響融合蛋白的性質，壹般需要純化後去除。
示蹤標記主要是指利用標記物本身的熒光或催化底物發出的熒光或可見光來檢測目標蛋白質在生物體內的定位、轉移和相互作用。示蹤標簽壹般分子量較大，因此需要在標簽和目標蛋白之間添加壹個接頭序列，以避免兩種蛋白之間的相互作用。示蹤標簽可以與檢測標簽結合使用，用於檢測和分析目標蛋白質，也可以與純化標簽結合使用，用於隨後的純化。
1) GFP、EGFP、YFP
GFP(綠色熒光蛋白)標簽含有238個氨基酸，其分子量約為26.9 KDa。在維多利亞多聚物水母中發現的蛋白質在紫外線照射下可以發出綠色熒光，與目標蛋白質融合不會顯著影響天然蛋白質的組裝和功能。EGFP標簽是壹種增強型綠色熒光蛋白。與GFP相比，EGFP標簽具有更高的折疊效率(由於正確折疊的蛋白質比例更高而增加熒光)、更強的熒光強度和更穩定的熒光性質。YFP(黃色熒光蛋白，YFP)標簽可視為綠色熒光蛋白的突變體，其熒光向紅色光譜移動。這些標簽與目標蛋白融合後，可以通過激光聚焦顯微鏡觀察融合蛋白在生物體內的情況，常用於亞細胞定位、熒光定位分析、活體熒光成像等實驗。可以在目標蛋白的N端或C端添加示蹤標簽，具體情況而定，比如細胞定位示蹤。如果定位序列位於靶蛋白的N端，則標簽應加在C端；如果定位序列位於C端，標簽應加到n端；如果定位序列位於中間，可以在N端或C端添加。
2)熒光素酶
熒光素酶(Luc)在分子生物學研究中常被用作“報告蛋白”。有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶、瓜西氏熒光素酶，能催化熒光素底物發出熒光。作為示蹤標記，Luc常用於活體成像、藥物分析等領域。將攜帶熒光素酶標簽(Luc)的質粒轉染到細胞中，引入到研究動物如大鼠和小鼠中，然後註射熒光素底物。通過生物發光成像技術(BLI)檢測光強的變化，從而實時監測疾病的發展或藥物的治療效果。還可以利用ATP對這個反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。
3)格斯
Gus tag是壹種細菌β-葡萄糖苷酸酶，能催化許多β-葡萄糖苷酸的水解。這種酶可以水解X-Gluc產生藍色物質。初始產物為無色吲哚衍生物，氧化二聚後形成5，5’-二溴-4，4’-二氯靛藍染料。這種靛藍染料使具有GUS活性的部分或部位呈現藍色，這可以用肉眼或在顯微鏡下觀察到。由於大多數植物細胞中沒有內源gus活性，GUS基因被廣泛用作轉基因植物的報告基因。作為融合標簽使用時，gus標簽可以放在目的蛋白的N端或C端，產生的融合蛋白壹般仍具有GUS活性，為研究外源基因表達的特定細胞位點提供了便利條件。
當然不是。幾乎任何標簽都可以用作檢測標簽。但這些標記應用廣泛，檢測靈敏度高，相應的抗體和試劑也比較成熟。它們是最常用的檢測標簽，可以作為添加檢測標簽時的首選。
當然，檢測標簽、凈化標簽、示蹤標簽在功能上並沒有絕對的界限。所有的檢測標簽也可以用於純化，但是需要制備相應的抗體並固定在純化基質上。比如S標簽需要將S蛋白固定在純化樹脂上，需要購買專門的純化柱材料，非常昂貴。當然也可以采用常見的方法，比如用蛋白A吸附抗體，再用抗體吸附融合的目的蛋白，但純化效率可能不會太高，吸附容量有限，成本較高(蛋白A柱材料價格是Ni-NTA柱材料的5-10倍)。雖然這種方法可以獲得極高的純度，但它沒有被廣泛使用。
標簽被選中。應該加到N端還是C端？在很多報道中，標簽通常加在目標蛋白的C端，因為蛋白質折疊是從N端開始的，在N端加標簽有被目標蛋白包埋的風險。但目前沒有統壹的標準，具體分析最好參考相關文獻。
壹般檢測標簽都是小標簽，對目的蛋白的功能和結構影響不大，N端和C端都可以用。需要註意的是，在使用雙標簽的情況下，如果有兩個小標簽，每側壹個。壹般不建議串聯兩個不同的標簽，比如壹個3×Flag檢測標簽和壹個His純化標簽，那麽3×Flag應該放在N端，His放在C端，因為純化後很有可能需要去掉3×Flag，如果兩個標簽互換就無法實現。
His標簽是應用最廣泛的標簽，既可以用於凈化，也可以用於檢測，大多數情況下不需要去除。將其加到N端可能會提前終止翻譯，產生的副產物不利於分離純化。當加入C端時，存在二次翻譯起始的可能，產生的副產物不利於分離純化。雙末端His有利於目的蛋白的準確檢測和純化，但可能會影響酶的活性。
純化標簽分子量大，大多數情況下需要去除，所以壹般放在目的蛋白的N端，檢測標簽放在C端。如果需要將大的純化標簽放置在C-末端，檢測標簽可以放置在靶蛋白的N-末端或融合蛋白的C-末端。然而，檢測標記不能放在目標蛋白和純化標記之間。
對於GFP標簽來說，大部分是用於目標蛋白的細胞定位，這個標簽的位置是由位置序列決定的。定位序列在C端，GFP應該放在N端，檢測標簽應該放在GFP的N端。相反，GFP應該放在C端，檢測標記應該放在GFP的C端。
當融合標簽對目的蛋白的功能和結構沒有影響時，不需要去除融合標簽，不僅對小標簽如此，對GST、MBP等大標簽也是如此。NEB公司純化的壹些核酸工具酶融合了MBP標簽。我在融合中表達了MBP-APOBEC3A，MBP不影響APOBEC3A的C→T活性。基因編輯技術中的AE和CE點編輯系統是基於Cas蛋白和APOBEC的。它們的分子大小差別很大，但功能互不影響，因為它們的功能域相對穩定，沒有蛋白質相互作用。如果融合標簽和目的蛋白也滿足這種關系，基本上不需要去除標簽，但是這種影響是不可預測的，可以參考相關文獻或者做前期實驗來確定。
常用於去除蛋白質標簽的蛋白酶及其識別序列如下表所示。
[1]蛋白質標簽[維基百科]，商業系統。應用微生物學。生物技術。, 2002, 60: 523–33.
[5] Nilsson，j .等人(1997)用於重組蛋白的檢測、純化和固定的親和融合策略。蛋白質表達。普裏夫。, 1997, 11: 1–16.
[6] Malhotra A .蛋白質表達的標記[M]//酶學中的方法。學術出版社，2009，463: 239-258。