中華人民共和國藥典(2010版)附錄八
2附錄ⅷ A western blot法本法中，待測樣品與特異性抗體結合後，抗體與酶標抗體特異性結合，通過酶促反應的顯色來檢查待測樣品的抗原特異性。
2.1試劑(1)TG緩沖液？稱取三甲基氨基甲烷15.12g和甘氨酸72g，加水溶解並稀釋至500ml。儲存在4℃下。
(2)EBM緩沖液？量取20ml TG緩沖液和40ml甲醇，加水稀釋至200ml。儲存在4℃下。
③TTBS緩沖區？稱取6.05克三甲基氨基甲烷和4.5克氯化鈉，量取0.55毫升聚山梨酯80，加適量水溶解，用鹽酸調節pH值至7.5，加水稀釋至500毫升。儲存在4℃下。
(4)底物緩沖液？稱取65438±05mg 3，3 '二氨基聯苯胺鹽酸鹽，加入5ml甲醇和65438±05μl 30%過氧化氫，加入25ml TTBS緩沖液溶解。隨時可以使用。
2.2檢驗方法按SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(藥典三部2010版附錄ⅳC)，供試品和陽性對照品的樣品量應大於100ng。取出凝膠，切去凝膠邊緣，在EBM緩沖液中浸泡30分鐘。另取6片厚濾紙和1片與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜浸泡在EBM緩沖液中。用半幹凝膠轉移儀轉移:將3張濕濾紙、1張硝酸纖維素膜、電泳凝膠、3張濕濾紙依次放在電極板上，蓋上電極板，在0.8mA/cm2硝酸纖維素膜恒流下轉移45分鐘。
取出硝酸纖維素膜，將其浸入密封溶液(10%新生牛血清的TTBS緩沖液或其他合適的密封溶液)中60分鐘。棄去液體，加入TTBS緩沖液10ml，搖勻，加入適量試驗抗體(按抗體說明書的稀釋度稀釋)，室溫過夜。硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液沖洗65438±0次，然後用TTBS緩沖液浸泡3次，每次8分鐘。棄去液體，加入TTBS緩沖液10ml，搖勻，加入適量生物素標記的第二抗體，室溫靜置40分鐘。硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液沖洗65438±0次，然後用TTBS緩沖液浸泡3次，每次8分鐘。棄去液體，用10ml代替TTBS緩沖液，搖勻，加入適量親和素溶液和生物素標記的辣根過氧化物酶溶液，室溫靜置60分鐘。硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液沖洗65438±0次，然後用TTBS緩沖液浸泡4次，每次8分鐘。棄去液體，加入適量底物緩沖液，室溫避光放置，待顯色程度適宜時，用水洗滌終止反應。
2.3結果陽性結果應顯示明顯的色帶。陰性結果不著色。
3附錄ⅷ B免疫斑點法該法體系利用特異性抗體與待測樣品結合，然後抗體與酶標抗體特異性結合，通過酶促反應的顯色來檢查待測樣品的抗原特異性。
3.1試劑(1) TG緩沖液？準確稱取三甲基氨基甲烷15.12g和甘氨酸72g，加水溶解並稀釋至500ml。儲存在4℃下。
(2) EBM緩沖？量取20ml TG緩沖液和40ml甲醇，加水稀釋至200ml。儲存在4℃下。
③TTBS緩沖區？稱取6.05克三甲基氨基甲烷和4.5克氯化鈉，吸取0.55毫升聚山梨酯80，加適量水溶解，用鹽酸調節pH值至7.5，用水稀釋至500毫升。儲存在4℃下。
(4)底物緩沖液？稱取DAB)15mg 3，3 '二氨基聯苯胺鹽酸鹽(DAB)，5ml甲醇和15μl 30%過氧化氫，溶於25ml TTBS緩沖液中。使用前準備。
3.2檢驗方法取硝酸纖維素膜，在EBM緩沖液中浸泡65438±05分鐘，在膜上點樣供試品、陰性對照品(可用人血白蛋白等量)和陽性對照品，上樣量應大於65438±00n g。在室溫下幹燥60分鐘。取出硝酸纖維素膜，將其浸入密封溶液(10%新生牛血清的TTBS緩沖液或其他合適的密封溶液)中60分鐘。棄去液體，加入TTBS緩沖液10ml，搖勻，加入適量試驗抗體(按抗體說明書的稀釋度稀釋)，室溫過夜。硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液沖洗65438±0次，然後用TTBS緩沖液浸泡3次，每次8分鐘。棄去液體，用10ml代替TTBS緩沖液，振搖加入適量生物素標記的二抗，室溫靜置40分鐘。硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液沖洗65438±0次，然後用TTBS緩沖液浸泡3次，每次8分鐘。棄去液體，用10ml代替TTBS緩沖液，振搖加入適量親和素溶液和生物素標記的辣根過氧化物酶溶液，室溫靜置60分鐘。硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液沖洗65438±0次，然後用TTBS緩沖液浸泡4次，每次8分鐘。棄去液體，加入適量底物緩沖液，室溫避光顯色，待顯色程度適宜時，用水洗滌終止反應。
3.3結果陽性結果應顯示明顯的色帶。陰性結果不著色。
4附錄ⅷ C免疫雙擴散法該法在瓊脂糖凝膠板上每隔壹定距離打幾個小孔，在相鄰的兩個孔中分別加入抗原和抗體。如果抗原和抗體相互對應，濃度和比例適當，經過壹定時間後，在抗原和抗體孔之間形成免疫復合物的沈澱線，從而檢查樣品的特異性。
4.1測試溶液的制備用生理氯化鈉溶液將測試樣品的蛋白質濃度稀釋至適當的濃度。
4.2試劑(1)0.5%氨基黑染色？稱取0.5克氨基黑10b0，加入50毫升甲醇、10毫升冰醋酸和40毫升水，溶解。
(2)脫色溶液？量取45毫升乙醇、5毫升冰醋酸和50毫升水，混合均勻。
4.3檢驗方法將完全溶脹的1.5%瓊脂糖溶液倒在水平玻璃板上(每平方厘米加入0.19ml瓊脂糖)，固化後按下圖打孔，直徑3mm，孔距3mm(方陣式)。根據需要確定正方形圖形的數量。中心孔加入抗血清，外圍孔加入試液，留1孔加入相應陽性對照血清。向每個孔中加入20μl樣品，然後將其放入水平濕盒中，在37℃水平鋪展24小時。用生理氯化鈉溶液充分浸泡瓊脂糖凝膠板以除去未結合蛋白質。浸泡過的瓊脂糖凝膠板在0.5%氨基黑溶液中染色。用脫色液脫色，直至背景無色，沈澱線呈清晰的藍色。通過適當的方法保存或復制圖集。
圖形方陣
4.4結果當每個陽性對照中出現相應的沈澱線時，試驗成立，供試品與人血清(血漿)抗體之間應出現相應的沈澱線，說明二者具有同源性。
附錄ⅷ D免疫電泳法該法體系通過電泳將待測樣品分離成區帶中的抗原，然後與相應的抗體進行雙相免疫擴散，兩者比例合適時形成可見的沈澱弧。通過將沈澱弧的位置和形狀與已知標準抗原和抗體產生的位置和形狀進行比較，可以分析樣品中的成分及其性質。
5.1試劑(1)巴比妥緩沖液(pH8.6)？稱取巴比妥4.14g和巴比妥鈉23.18g，加適量水，加熱溶解，冷卻至室溫，加入疊氮化鈉0.15g，加水溶解成1500ml。
(2)0.5%氨基黑染料？稱0.5g氨基黑10b0。加入50毫升甲醇、10毫升冰醋酸和40毫升水溶解。
(3)1.5%瓊脂糖溶液？稱取瓊脂糖1.5g，加入50毫升水和50毫升巴比妥緩沖液，加熱至完全溶脹。
(4)脫色溶液？量取45毫升乙醇、5毫升冰醋酸和50毫升水，混合均勻。
(5)溴酚藍指示劑？稱取50mg溴酚藍，加水溶解成100ml。
5.2參考物質正常人血清或其他合適的參考物質。
5.3測試溶液的制備使用生理氯化鈉溶液將測試樣品的蛋白質濃度稀釋至0.5%。
5.4檢驗方法:將1.5%瓊脂糖溶液倒在大小合適的水平玻璃板上，厚度約3mm，靜置。待凝膠凝固成均勻無氣泡的薄層後，在瓊脂糖凝膠板的負極上下各打1孔，直徑3mm，孔距10 ~ 15。向測量孔中加入10μl試驗溶液和1滴溴酚藍指示劑，向對照孔中加入10μl正常人血清或人血漿和1滴溴酚藍指示劑。用三層濾紙橋接與巴比妥緩沖液(電泳緩沖液)接觸，100V恒壓電泳約2小時(指示劑移至前方)。電泳後，在兩孔間距離兩端約3~5mm處挖壹個3 ~ 5 mm的槽，向槽內加入血清抗體或人血漿抗體，直至槽滿但不溢出。在37℃的濕度釋放箱中擴散24小時。擴散後，用生理氯化鈉溶液充分浸泡瓊脂糖凝膠板，以除去未結合蛋白質。將浸泡過的瓊脂糖凝膠板用0.5%氨基黑溶液染色，然後用脫色液脫色至背景基本無色。通過適當的方法保存或復制圖集。與對照品相比，樣品的主要沈澱線應為待測蛋白。
5.5註意事項(1)電泳時要有冷卻系統，否則瓊脂糖凝膠會開裂。
(2)生理氯化鈉溶液浸泡要充分，否則背景不清。
6附錄ⅷ E肽圖檢查方法蛋白質被蛋白酶或化學物質裂解後，通過適當的分析方法鑒定蛋白質壹級結構的完整性和準確性。
6.1第壹種方法？按HPLC (2010版藥典第三部附錄ⅲB)測定，采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法。
6.1.1色譜條件:以蛋白質和多肽分析用辛基矽烷鍵合矽膠或十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；柱溫為30℃±5℃，對照品和供試品的貯存溫度為2 ~ 8℃；以0.1%三氟乙酸水溶液為流動相A，0.1%三氟乙酸乙腈溶液為流動相B，流速為1ml/分鐘，梯度洗脫70分鐘(溶液A從100%到30%，溶液B從0-70%)。
6.1.2檢驗方法取供試品溶液和對照品溶液(每1ml均含1mg，供試品溶液和對照品溶液濃度不夠時，應濃縮至相應濃度)，分別用1%碳酸氫銨溶液充分透析。按1: 50 (mg/mg)加入胰蛋白酶溶液【取經甲苯磺酰丙酰氯酮處理(或經序列分析純化)的胰蛋白酶適量，加入1%碳酸氫銨溶液，制成每1ml含0.1mg的溶液】加到供試品溶液和對照品溶液中，加入供試品溶液中。按1: 10的比例加入50%的醋酸溶液，以10000 rpm的速度離心5分鐘(或用0.45μm濾膜過濾)，精確量取100μl的上清液，分別註入液相色譜儀，梯度洗脫，記錄色譜圖。將供試品溶液的光譜圖與對照品溶液的光譜圖進行比較，得到產品。
6.2第二種方法？溴化氫熱解試驗？取供試品和對照品(約50μg蛋白質)適量，用水透析16h，冷凍幹燥，加入20μ l溴化氫裂解液(稱取0.3g溴化氫，加入180μl甲酸(70 → 100)溶解)，室溫靜置24h，向裂解液中加入65438+。用水將凍幹的溶胞產物重新溶解至合適的濃度。根據SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(附錄ⅳC)(凝膠濃度20%)進行電泳，並使用銀染。
將供試品色譜與對照品色譜進行比較，得到產品。
7附錄ⅷ gA群腦膜炎球菌多糖分子大小測定方法7.1第壹法？磷的測定(仲裁法)該方法用於測定細菌莢膜多糖在色譜柱中的分配系數(KD)和規定KD值前多糖的回收率。
7.1.1試劑(1)流動相？稱取氯化鈉11.7g和疊氮化鈉0.1g，加水溶解成1000ml，混勻，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0。
(2)藍色葡聚糖2000溶液？稱取200020mg藍色葡聚糖，加入流動相溶解成10ml。
(3)維生素B12溶液？稱取10mg維生素B12，加入流動相溶解成10ml。
7.1.2色譜柱的制備取約200ml瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL4B凝膠，加入400ml流動相，充分攪拌，靜置約1小時沈澱，倒出含有懸浮顆粒的上層懸浮液。如此重復3 ~ 5次後，加入200ml流動相，混勻，除去凝膠中的空氣，置於1.5cm×90cm高約87cm的色譜柱中，以15 ~ 20ml/小時的流速用流動相洗脫，用2 ~ 3倍柱床體積(約500ml)的流動相洗脫，制成。
7.1.3色譜柱校準取1ml藍色右旋糖酐2000溶液，加入平衡色譜柱，用流動相以每小時15 ~ 20 ml的流速洗脫，用組分收集器收集洗脫液，每管取3 ~ 5 ml，按紫外-可見分光光度法(附錄ⅱA)在波長260nm處測定每管洗脫液。
量取1ml維生素B12溶液，從“加入平衡色譜柱”開始操作相同。在370nm處的峰值洗脫液體積是柱床體積Vi。
7.1.4測定方法取約1毫升供試品(含3 ~ 5毫克多糖抗原。如為凍幹品，可用流動相溶解)，加入已校準的色譜柱，用流動相洗脫，用組分收集器收集5ml洗脫液，按《磷測定法》(藥典三部2010版附錄VII A)測定。以每管洗脫液的磷含量為縱坐標，洗脫液體積(ml)為橫坐標作圖，主峰峰值處的洗脫液體積為Ve。
按以下公式計算:
在配方裏？KD是樣本的分布系數；
Ve為供試品洗脫液的體積，ml；
VO為空流量，ml；
Vi是柱床體積，ml。
計算試樣的KD值
其中RX是KD值
AX是KD處測試樣品的值
a是供試品所有試管洗脫液中磷含量的總和。
7.2第二定律？儀器法制備試劑和色譜柱與第壹種方法相同。
7.2.1色譜柱校準量為1ml藍色葡聚糖2000溶液和0.2ml維生素B12溶液；混合後加入平衡色譜柱，流動相洗脫，流速為15 ~ 20ml/h，檢測波長為206nm，用組分收集器收集洗脫液，記錄色譜圖。色譜圖中，第壹峰為藍色葡聚糖2000峰，峰處洗脫液體積為空流量VO；第二個峰是維生素B12，峰處的洗脫液體積是柱床體積Vi。
7.2.2測定方法取供試品(含多糖抗原3 ~ 5mg，若為凍幹品，可用流動相溶解)約1ml，加入已校準的色譜柱中，用流動相洗脫，流速為15 ~ 20ml/h，檢測波長為206nm，用組分收集器收集洗脫液，記錄色譜圖。按以下公式計算:
在配方裏？KD是樣本的分布系數；
Ve為供試品洗脫液的體積，ml；
VO為空流量，ml；
Vi是柱床體積，ml。
計算試樣的KD值
其中RX是KD值
AX是KD處測試樣品的值
At是測試樣品的色譜總面積。
7.3註:過柱作業應在10 ~ 20℃下進行。
附錄ViII H傷寒VI多糖分子大小的測定該方法用於測定細菌莢膜多糖在色譜柱中的分配系數(KD)和規定KD值前多糖的回收率。
8.1試劑、色譜柱制備和色譜柱校準同附錄VIII G中第二種方法..
8.2測定方法取供試品約65438±0ml(含3 ~ 5mg多糖抗原)，加入到已校準的色譜柱中，用流動相以65438±0.5 ~ 20ml/h的流速洗脫，用組分收集器收集洗脫液，每管3 ~ 5ml。按照O-乙酰基測定方法(藥典三部2010版附錄ⅵ F)，測定每管中O-乙酰基含量，計算O-乙酰基含量最高時的洗脫體積，即為多糖主峰峰值時的洗脫體積Ve。
按以下公式計算:
其中KD為樣品的分布系數；
Ve為供試品洗脫液的體積，ml；
VO為空流量，ml；
Vi是柱床體積，ml。
計算KD ≤0.25時供試品的多糖回收率；
其中RX為KD ≤0.25的多糖回收率，%;
AX為KD值≤0.25的各管洗脫液等體積合並溶液的O乙酰基含量；
At是含有相同體積試樣的所有試管洗脫液的混合溶液中的O乙酰基含量。
人體表面積計算器身體質量指數指數的計算和評估女性安全期計算器預產期計算器孕期正常體重增加用藥安全分類(FDA)五行和八字成人血壓評估體溫水平評估糖尿病飲食建議臨床生化常用單位轉換基礎代謝率計算鈉補充計算器鐵補充計算器處方常用拉丁文縮寫快速檢查藥代動力學常用符號快速檢查有效血漿滲透壓計算器酒精攝入量計算器
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8.3註意過柱操作是在10 ~ 20℃下進行的。
9附錄VIII I殘留牛血清白蛋白的測定本法體系采用酶聯免疫吸附法測定樣品中殘留牛血清白蛋白的含量。
9.1供試品溶液的制備如果供試品為凍幹劑型，應在試驗前按標示量復溶，然後混勻，並在室溫下靜置30分鐘，再次混勻後再進行試驗。如果樣品是液體劑型，可以直接用於檢測。
9.2幹擾試驗首次用該方法檢測的試樣應進行幹擾試驗。
制備溶液I(供試品稀釋倍)、溶液II(供試品與30ng/ml內標混合)和溶液III(供試品稀釋倍，內標稀釋30 ng/ml)。當測試溶液的BSA含量高於試劑盒測量範圍的中點時，將溶液I和溶液II稀釋兩次後配制。溶液ⅰ和溶液ⅱ可通過多次稀釋測定，溶液ⅲ應通過孔隙率(至少10孔)測定，並在試驗箱中均勻加入。根據測定方法，分別測定溶液I、溶液II和溶液III中牛血清白蛋白的含量。溶液I和溶液II的含量之差應在溶液III測定值的95%置信區間內，表明供試品不會幹擾檢測方法。
9.3測定方法應按試劑盒說明書進行，供試品用試劑盒提供的稀釋劑稀釋。試樣應至少測量兩次，每次稀釋應平行測量兩個孔。試劑盒標準物質的吸光度、內控對照品的測定值、標準物質的線性相關系數、雙孔測定的吸光度應在試劑盒要求範圍內，檢測有效。用標準溶液的濃度對相應的吸光度進行線性回歸，將樣品的吸光度代入線性回歸方程，然後乘以稀釋倍數，計算出樣品中BSA的含量。
9.4註(1)當同壹樣品的低稀釋吸光度明顯低於高稀釋吸光度時，可能存在掛鉤效應或操作失誤，需要重試或調整稀釋倍數進行檢測。
(2)測定BSA含量的容器應專用於防止BSA汙染實驗室。
10附錄八流感嗜血桿菌JB聯合疫苗多糖含量的測定該法系根據可溶性糖經無機酸脫水生成甘油醛(戊糖)或甘油醛衍生物，產物可與酚類化合物縮合生成有色物質來測定多糖的含量。
10.1試劑(1)0.1%氯化鐵鹽酸溶液？準確稱取0.1g氯化鐵(FeCl 3·6H2O)，置於幹凈的試劑瓶中，加入100ml鹽酸，溶解後置於2 ~ 8℃冰箱中保存。
(2)逆戟天醇(3，5二羥基甲苯)[1]乙醇溶液？稱取逆戟天醇1g，置於10ml容量瓶中，加入95%乙醇至10ml。使用前準備。
(3) 25μg/ml核糖對照溶液？稱取D-核糖1.25mg，置於50毫升量瓶中，溶於水並稀釋至刻度。
10.2測定方法量取1ml水，加入5ml 0.1%氯化鐵鹽酸溶液，混勻，再加入0.4ml依諾醇乙醇溶液，混勻。水浴5分鐘，然後冰浴，在670nm波長處測量吸光度作為空白對照。
先將供試品用水稀釋至核糖含量不高於25μg/ml，取1.0ml作為供試品溶液，從“加入5ml 0.1%氯化鐵鹽酸溶液”開始，同樣操作。
分別取0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml核糖對照溶液於10ml試管中，每管依次加入0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml和0ml水。
結果計算10.3用核糖對照溶液的濃度對其對應的吸光度進行線性回歸，得到線性回歸方程。將試液的吸光度代入線性回歸方程，求出試液的核糖含量。
供試品中多糖的含量(μg/ml)a×n/0.41。
式中，a為供試品溶液中核糖的含量，μg/ml；
n是試樣的稀釋倍數。
11附錄ⅷ K己二酰肼含量的測定該法律制度基於己二酰肼(ADH)中的氨基在四硼酸鈉的條件下能與三硝基苯磺酸(TNBS)反應，用紫外-可見分光光度法測定B型流感嗜血桿菌多糖衍生物中己二酰肼的含量。
11.1試劑(1)己二酸二酰肼參考儲備液(1mg/ml)？準確稱取己二酸二酰肼0.100g，加水定容至100ml，儲存於20℃。
(2)己二酰肼對照品工作溶液(20μg/ml)？精確量取0.2毫升ADH參考儲備液，加水定容至10毫升。
(3)5%四硼酸鈉溶液？稱取四硼酸鈉(na 2 B4 o 7.10h2o)47.35g[1]，加水至500ml，室溫保存。
(4) 3% TNBS溶液？量取5毫升TNBS，加水至50毫升，儲存於20℃。
11.2測定方法量取1.0ml 5%四硼酸鈉溶液，加入1ml水，混勻，再加入0.3ml 3% TNBS溶液，混勻，室溫靜置15分鐘，在500nm波長處測定吸光度作為空白對照。先將試樣用水稀釋至己二酸二酰肼濃度不高於20μg/ml，然後取1.0ml，加入1.0ml 5%四硼酸鈉溶液，從“加入0.3ml 3% TNBS溶液”開始同樣操作。
分別取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml己二酸二酰肼對照品工作液於試管中，每管依次加入0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml和0ml水，加入1.0ml 5%四硼酸鈉溶液，從“加入3% TNBS。結果計算？將相應的吸光度與己二酸二酰肼對照溶液的濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程。將試液的吸光度代入線性回歸方程，得到試液中己二酸二酰肼的含量，根據稀釋倍數計算試液中己二酸二酰肼的含量。
12附錄ⅷ l高分子結合物的測定本法利用高分子結合物、低分子結合物和遊離多糖在不同乙醇濃度下沈澱分離，采用紫外-可見分光光度法測定磷含量，計算高分子結合物的含量。
12.1試劑(1) 5mol/L氯化鈉溶液？準確稱取29.22g氯化鈉，加水溶解並稀釋至100ml，室溫保存。
(2) 1.5mol/L硫酸？將11體積的水加入1體積的98%硫酸中，並充分混合。
(3) 2.5%鉬酸銨？稱取2.65克[1]鉬酸銨，加水溶解並稀釋至100毫升。
(4)10%抗壞血酸？稱取抗壞血酸10g，溶於水並稀釋至100ml。
(5)礦化試劑？硫酸和70%高氯酸等體積混合。
(6)顯色試劑？將水、1.5mol/L硫酸、2.5%鉬酸銨和10%抗壞血酸按體積比2:1:1:1混合。
(7)80μg/ml磷參考儲備液？精確稱取0.3665g磷酸氫二鈉或0.3509g[1]在100℃幹燥的磷酸二氫鉀，加入500ml水和10ml 5mol/L硫酸溶液溶解，加水至1000ml。使用時，將原液稀釋20倍，即為4μg/ml磷對照品的工作液。
(8)1.0mol/L氫氧化鈉溶液？稱取4g氫氧化鈉，加水溶解並稀釋至100ml。
12.2試液的配制(1)分步沈澱？用生理氯化鈉溶液稀釋原液至多糖含量為20-28 μ g/ml或成品疫苗為3ml，加入5mol/L氯化鈉溶液0.75ml，混勻後加入15ml無水乙醇，置於20℃冰箱中72-96小時，以8000 rpm離心至4℃90分鐘，吸取上清液作為供試品溶液2；向沈澱物中加入0.5ml 50%乙醇溶液，加入玻璃珠，混合，室溫放置65438±0小時；加入1.5ml 50%乙醇溶液，混勻，室溫靜置2h，8000 rpm離心1h，吸取1.8ml上清液作為供試品溶液3；向沈澱物中加入0.5ml 1.0mol/L氫氧化鈉溶液，混合並在室溫下放置1小時，加入1.25ml水作為供試品溶液4。
(2)取多糖含量為20 ~ 28 μ g/ml的1.0ml原液或成品疫苗作為檢驗樣品。
(3)試液的礦化？分別量取1.0ml供試品1、1.5ml供試品溶液2、0.7ml供試品溶液3和0.5ml供試品溶液4；分別加入礦化劑0.15ml，在150℃幹燥1h，然後升溫至180℃保持30分鐘，再升溫至250℃保持1h。
12.3測定方法取1.95ml水，加入50μl礦化劑，再加入2.0ml顯色劑，混勻，然後37℃水浴2h，在825nm波長處測定吸光度作為空白對照。
向礦化試液中加入1.85ml水和2.0ml顯色劑，混勻，然後37℃水浴2h，在825nm波長處測量吸光度。
分別量取0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml和1.0ml的磷對照品工作溶液於試管中，每管依次加入1.85ml、1.75ml、1.55ml和1.655。然後在每支試管中加入50μl礦化劑，再加入2.0ml顯色劑，混勻，置於37℃水浴中2小時，在825nm波長處測量吸光度。
結果計算12.4對應的吸光度由磷參比溶液的濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程。將試液的吸光度代入線性回歸方程，求出磷含量。
樣品的磷含量(微克/毫升)如下:
P1 (A1×3)/1.0
P2(A2×18。75)/1.5
P3(3×2.0)/0.7
P4(a4×2.0)/0.5(P3×10)/100
測試有效性？80%≤p 1/(P2+P3+P4)≤120%
試樣中聚合物共軛物的含量(%)P4/(P2+P3+P4)×100
供試品中遊離多糖的含量(%)[1 P4/(P2+P3+P4)]×100。