在完成壹系列切片後，要對切片進行染色和密封。由於待染色的切片仍包裹在石蠟中，而所用的染色溶液是水性的，因此染色前必須再次脫水。與固定組織塊的脫水和清除步驟不同，石蠟切片首先要在二甲苯中溶解以去除石蠟，然後再經過不同程度的酒精，最後到水。
染色後，如果組織切片中有水分，光線就不能通過，在顯微鏡下就無法觀察到組織的結構，因此必須經過脫水處理。
把我們學校的實驗講義給妳看看吧~希望對妳有幫助~不懂就問我~
實驗 1 石蠟包埋切片技術
實驗目的：
1.了解石蠟包埋切片技術的基本原理和基本步驟；
2. 掌握石蠟包埋切片技術。
實驗原理：
在生物實驗中，我們觀察過動物組織和植物組織的切片。通過光學顯微鏡，我們可以觀察到細胞的內部結構（如細胞核、細胞質、肌肉組織的橫紋等）、細胞之間的聯系、組織的成分等。那麽，如何制作這樣的切片呢？這個過程很復雜，我們通過 3-4 個實驗來學習如何制作組織切片。
大家都知道，我們要在顯微鏡下研究生物體的內部結構，在自然狀態下是觀察不到的，因為動植物的整個軀體大多是不透明的，不能在顯微鏡下直接觀察，必須經過特殊處理，使要觀察的物質先把它的厚度和體積減小，使光線能夠通過，才能用顯微鏡觀察。通常有兩種方法：壹種是不切片法，即用物理或化學方法將生物體的組織分離成單個細胞或薄片，比如我們在生物學實驗中做過的觀察洋蔥球莖表皮的口腔上皮。這種方法的缺點是不壹定能觀察到細胞之間的相互聯系。另壹種是切片法，即用刀將標本切成薄片。
非切片法比較簡單，壹學就會，這裏不再介紹。
切片法又分為徒手切片法和切片機切片法。最簡單的切片方法是直接用刀把新鮮的植物材料切成薄片，稱為徒手切片法。切片機切片法是使用特制的切片機將植物切成薄如幾微米的薄片。因此，切片機的發明和使用也是細胞學誕生的壹個重要因素。
切片機也是用刀（切片刀）來切組織的，要切片的組織必須具有壹定的柔軟度，比如用刀切肉（新鮮的、冷凍的）。然而，大多數生物材料都相對較軟，因此為了能夠切出薄片，被切割的材料必須首先具有壹定的柔軟度。有些包埋劑就能達到這個目的，比如石蠟，它在熔化時能滲入組織；凝固時，使整個組織具有壹定的軟硬度，剛好能切出很薄的切片，所以被稱為石蠟包埋切片法。此外，還有石棉包埋切片法（以石棉為包埋劑）、冷凍切片法（使組織冷凍到壹定硬度）等。其中，最常用的切片方法仍是石蠟包埋切片法，我們在此重點介紹石蠟包埋切片技術。
實驗器材：
（壹）小鼠、小廣口瓶、標簽、量筒、燒杯、95%酒精、無水乙醇、蒸餾水、手術刀、剪刀、鑷子、平皿、石蠟塊、濾紙、甲醛溶液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。
(ii) 恒溫器、熔化的蠟、紙盒、熱板、支架、酒精燈、火柴、小鑷子、濾紙。
(二) 恒溫器、紙盒、熱板、支架、酒精燈、火柴、小鑷子、濾紙。
（c）手術刀、木板、酒精燈、火柴、鋸條、木塊、塑料板、切片刀、切片器、刷子、小鑷子、載玻片、蛋白甘油、恒溫水浴鍋、溫度計、大白板。
實驗步驟：
制作小鼠肝、脾、腎、小腸切片。
1、取材：取材是指從動物或植物體上切取需要觀察的組織材料，如植物的莖、葉，動物的肝、小腸等。
取材時應註意以下幾點：
（1）新鮮：材料切取越快越好，否則會改變動植物體的細胞成分、結構和分布。
（2）防止人為損傷：如生拉、擠壓等，避免人為損傷。
（3）尺寸：0.5 厘米×0.5 厘米×0.2 厘米。
2、固定：生物體死亡或組織解離後，組織細胞會因血液供應停止而缺氧，導致生物氧化過程停止。相反，細胞內厭氧發酵酶活躍，使組織中蛋白質、糖類、脂肪降解，造成組織自溶。此外，組織還會因汙染菌而發生腐敗。因此，為了保持細胞和組織結構與生前壹樣，必須進行適當的固定。固定的目的是保存組織內細胞的形態、結構及其組成，使其與生前相似。
固定組織的物質--固定劑--具有凝固或沈澱組織蛋白質的作用，因此可以抑制發酵酶的活性和細菌的繁殖，從而達到固定組織的目的。
固定劑有很多種，最常見的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞和滲透酸等八種。各種定影劑對蛋白質、脂肪、糖類等的作用各不相同，因此，單壹定影劑無法保存所有成分，所以多采用混合定影劑。
特別介紹了各種有關固定劑的書籍，如化學性質、固定原理、固定組織的優缺點等。由於時間關系，這裏就不詳細介紹了，只介紹幾種常用的固定劑及其配方和用途。
（1）10%福爾馬林溶液：1份甲醛溶液+9份蒸餾水
市面上出售的甲醛溶液大約含有37-40%的甲醛，而10%的福爾馬林溶液實際上只含有3.7-4.0%的甲醛。
適用範圍：各種組織。但用 10%福爾馬林溶液固定的組織，細胞核染色較好，細胞質染色較差。
處理：組織塊壹般固定 16-24 小時，也可長期固定，甚至可用於組織塊的長期保存。短期固定的組織塊無需清洗，可直接轉入70%酒精脫水。
（2）布因溶液：苦味酸飽和水溶液（1.22%）75ml（15）
甲醛溶液 25ml（5）
冰醋酸 5ml（1）
適用範圍：各種動物組織和植物組織的根尖，是動物組織的良好固定劑。
處理方法：固定 24h，也可在此溶液中長期保存。流水沖洗或直接放入 70%酒精中脫水，無需水洗。
（3）Zenker 溶液：A 液：氯化汞 5g
重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1g
蒸餾水 100ml
B 液：冰醋酸 5ml
兩液混合後使用。
適用範圍：它是壹般動物組織的優良固定劑，用它固定的組織的細胞核和細胞質染色相當清晰。
處理方法：固定時間為 16-24 小時，然後用流動清水沖洗壹夜，洗去氯化汞，再放入 70% 的酒精中脫水。切片染色前用碘液除去汞沈澱。
（4）Gendre 溶液：苦味酸飽和酒精溶液（8.96g/100ml95%酒精）85ml
甲醛溶液 10ml
冰醋酸 5ml
適用範圍：用於檢查動物組織中的糖原（因為糖原溶於水）。
處理：固定 3-6h 後，直接轉入 95%酒精中脫水。
（5）卡諾溶液：無水乙醇 60ml
三氯甲烷 30ml
冰醋酸 10ml
適用範圍：用於檢查動物組織中的核酸、糖原等。
處理方法：固定 2-6 小時，直接轉入 95%酒精脫水。
還有其他多種固定液。應根據需要固定的材料和檢查目的來選擇固定液。
3、沖洗：材料從固定液中取出後，需立即沖洗，使其中的固定液全部去除，以防染色。
有些固定劑，如10%福爾馬林溶液、布氏溶液固定的材料，如果時間比較短可能不需要沖洗。但如果時間過長，沖洗也是必要的。
沖洗的方法：將組織塊放入瓶中，瓶中插入軟管，接上自來水，瓶口用紗布包好。流水沖洗壹夜，即能達到沖洗目的。
4、脫水：脫水的目的是使組織中的水分完全去除。因為組織塊中會嵌入石蠟
，而水和石蠟是不相溶的。在進入包埋階段之前，必須對組織塊進行脫水處理。
常用的脫水劑有乙醇、丙酮、正丁醇等，其中最常用的是乙醇。利用脫水劑吸水的特性，組織中的水分會在各級濃度的脫水劑中逐漸被吸收。乙醇脫水過程壹般從 70% 的乙醇開始，經過 80%、90%、95% 和 100% （二次）完成脫水過程。每次向後轉移前，必須用吸水紙將組織塊上的液體吸幹，以免影響後續乙醇的濃度。
脫水時應註意：(1）在高濃度或無水乙醇中，每級停留時間不宜過長，否則會使組織收縮變脆，影響切片；（2）如需過夜，應在70%乙醇中停留，也可長期保存，這樣可防止因時間倒置而影響後續步驟。
5.透明度：脫水後是否可以進入包埋？但由於脫水劑和石蠟也是不相溶的，所以在包
埋前，需要壹種既能溶於脫水劑又能溶於石蠟的物質--透明劑--來起到中間置換的作用
。
因此，透明劑的作用就是用透明劑置換組織中的乙醇或丙酮，使石蠟能非常順利地進入組織。此外，它還能增強組織的折射率，因此被稱為透明質酸。
透明質酸的種類很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯是最常用的透明劑，二甲苯可溶於乙醇和乙醚，也可作石蠟溶劑，但不溶於水，它的透明力很強。
透明工藝：壹般經過1/2二甲苯-1/2無水乙醇，兩次二甲苯。
徹底透明的標準：胃、腸、結締組織等比較透明；肝、腎、心、肌肉等組織處於暗紅色油浸狀態，再脫水，透明度好。如果組織放入二甲苯中 30min 後仍不變色，或中心發白，說明水分未脫凈，應返回無水乙醇中繼續脫水。透明這壹步至關重要，如果透明時間不夠，石蠟進不去，無法切片；如果透明時間過長，組織收縮變脆變硬，切片易碎。這壹步要靠經驗。
6、浸蠟：浸蠟是石蠟滲入整個組織的過程。
所謂石蠟包埋切片法，就是用石蠟將組織塊浸潤包埋，然後切片染色的
切片方法。
石蠟是最常用的包埋劑，石蠟有多種類型，熔點各不相同，通常使用的石蠟熔點為54-58攝氏度。
浸蠟過程：將已熔化的石蠟在60℃的溫箱中浸漬2次，每次1h，使石蠟浸漬組織。
浸蠟時，溫度不宜過高，浸蠟時間不宜過長，否則會使組織變硬、變脆，影響切片。
7、包埋：包埋是將浸過石蠟的組織連同溶解的石蠟壹起，倒入壹定形狀的器皿（如紙盒、平盤）中，然後凝固成蠟塊的過程。
包埋的過程：
（1）折疊紙盒；
（2）用酒精燈加熱溫臺和紙盒；
（3）將熔化的石蠟倒入紙盒；
（4）將組織塊切面朝下，擺放在合適的位置；
（5）蠟塊凝固。
從提取到包埋是壹個連續的過程，往往要連續進行幾天，如果沒有計劃和良好的組織，可能會與其他上課時間沖突，或者導致半夜聽課。有時僅憑記憶，顛倒順序或超過規定時間都會導致實驗失敗。因此，需要提前準備好時間表。
建議時間
乙醇脫水：70%:16:30
80%：第二天 7:20
90%：9:20
95%：11:00
100%（Ⅰ）：12:00
100%（Ⅱ）：13:00
透明：1/2 二甲苯-1/2 無水乙醇：14:00
二甲苯（Ⅰ）：14:20
二甲苯（Ⅱ）：14:40
浸蠟：石蠟(Ⅰ):15:00
石蠟(Ⅱ):16:00
浸蠟：17:00
註意事項：(1)動作要快；(2)熔蠟要快；(2)熔化的蠟不要滴到桌上或地上。
8、切片：嵌入後即可切片。切片前，需要修剪好嵌入的組織塊，並將其固定在木塊上，然後再切片。
修整組織塊：以每個組織塊為單位，用刀將組織塊大致修整成長方形或梯形，並在組織周圍留出 1-2 毫米寬的蠟邊。
固定：用酒精燈燒熱金屬片，將組織塊切面的對立面稍稍熔化，並立即貼在木塊上。
切片機的構造：
切片機是用來制作各種組織切片的器械，它的樣式很多，性能各異，壹般可分為滑動式切片機和旋轉式切片機兩大類。我們使用的是旋轉切片機。其主要結構分為三部分：（1）控制切片厚度的微動器；（2）切片刀裝置的夾持部分；（3）組織塊裝置的夾持部分。旋轉輪每旋轉壹圈，微型執行器就會根據調整好的切片厚度，在水平方向上將組織塊向前推進壹個切片厚度。
切片操作：
（1）固定切片刀：刀片向上並保持水平。調整角度，壹般為 4-6 度。
（2）固定組織塊。
（3）調整所需的切片厚度：壹般為 6-10 微米。
(4)移動刀架，或拔掉齒輪上的拖鉤，來回轉動齒輪，以移動組織塊支架，調整組織塊表面與刀片之間的距離，直到剛剛好。
（5）調整紙巾塊與刀片之間的角度和位置：紙巾塊的切面和上下邊緣必須與刀片平行。
（6）粗切：右手搖動滾輪，左手轉動齒輪，將紙巾塊慢慢切成紙巾本身。
（7）切片：右手轉動曲柄輪，轉壹圈可切下壹片，切下的第二片與第壹片連在壹起，即為連續切片。左手用鑷子或刷子提起切片的下端，輕輕向自己的方向拽，使切片成為連續的帶狀。
（8）展開切片：停止切片，右手用另壹把刷子輕輕跳起蠟帶，由刀刃壹側向下，慢慢接觸40-45℃的水面，借助水的表面張力使其在水中展開。如果有小皺褶，可用小鑷子輕輕分開。需要註意的是：水溫過高，容易將切片全部融化；水溫過低，切片不宜拉伸。
（9）貼片：即把切片貼在載玻片上。首先，將連續的切片分成壹片或壹小段。在載玻片的 1/2 處均勻塗上壹層薄薄的蛋清甘油（蛋清和甘油等量，以防脫落）。不要塗得太多！），將載玻片垂直插入水中，塗有蛋白甘油的壹面靠近組織切片，然後提起載玻片，使組織切片粘在載玻片上。用小鑷子將切片夾在載玻片 1/3 和 2/3 的交界處，並正確定位。然後將它們放在 52-60°C 的恒溫器中烘烤。
至此，整個石蠟包埋切片技術全部完成。
實驗二 蘇木精-伊紅染色
實驗目的：1、了解染色的基本原理和基本方法；
2、掌握蘇木精-伊紅染色方法。
實驗原理：
壹．染料常識
1．染料染色的原理：（1）化學作用：染料的性質有酸、堿、中性之分，則組織的堿性部分（如細胞質）易與酸性染料親和作用，組織的酸性部分（如染色質）易與堿性染料親和作用。(2）物理作用：指吸附或溶解。組織蛋白與某些染料有相互吸附作用。
2、媒染劑、促染劑和分化劑
媒染劑：有些天然染料（如蘇木精），本身沒有著色，要與其他物質結合才有著色，這些物質稱為媒染劑，如許多鐵鹽、鉻鹽和鉀鹽等。
促進劑：是促進染料著色的物質，如冰醋酸是曙紅的促進劑。
分色劑：使切片上需要顯示的結構清晰，而使不需要顯示的結構脫色的物質。例如，1%鹽酸酒精。
I.
石蠟包埋切片的染色方法很多，應根據不同的檢查目的選擇不同的染色方法。最常用的染色方法是H.E.染色。
1、蘇木精（hematoxylin，蘇木精紫）（hematoxylin）：從蘇木精中提取。蘇木精本身不是染料，不能直接染色，必須經過氧化才能染色。它可以在空氣中自然氧化，但需要較長的時間，所以通常要加入氧化劑（如碘酸鈉）進行氧化。同時，染色後的物質必須經過媒染劑的作用才能著色，所以在配制蘇木精染料溶液時，都要加入媒染劑。蘇木精溶液主要對細胞核進行染色。
蘇木精有幾種不同的配方。
邁爾（Mayer）的蘇木精溶液：
蘇木精 1 克
硫酸鋁鉀 50 克（媒染劑）
碘酸鈉 0.2 克
水合氯醛 50 克
檸檬酸 1 克
蒸餾水 1000 毫升
2、曙紅（eosin）（蘇木精）：曙紅有幾種。
3、曙紅（eosin）：又分幾種，如曙紅 Y、曙紅 B 等。
曙紅對細胞質、肌纖維和膠原纖維有著色作用。
壹般使用0.5%曙紅/70%乙醇溶液或1%曙紅水溶液。
由於蘇木精染色的是細胞核，而曙紅染色的是細胞質，因此這種方法稱為雙對比染色法。
實驗材料：石蠟切片、蓋玻片、小鑷子、大鑷子、口香糖、濾紙、紗布、染色缸、二甲苯、乙醇系列、Mayer蘇木精液、0.5%伊紅液（或1%伊紅水溶液）、1%鹽酸酒精、蒸餾水、顯微鏡。
實驗步驟：
1、切片脫蠟、復水：
由於待染色的切片仍包裹在石蠟中，而所用的染色液又都是水溶液，所以染色前必須再次復水。與固定組織塊的脫水和清除步驟不同，石蠟切片首先要在二甲苯中溶解以去除石蠟，然後再經過不同程度的酒精，最後進入水溶液。
將切片放入裝有二甲苯的染色桶中溶解石蠟（20 分鐘），然後再經過第二桶二甲苯（10 分鐘）。經100%、95%、90%、80%、70%各級酒精後，註入蒸餾水，每級3-5min。
2、放入蘇木精溶液中染色5-7min。
3、流水洗去附著的染色劑，（在1%鹽酸酒精中浸3-4次），再流水沖洗20min，使切片由淺紅色變為灰蘭色。
4、放入伊紅染色5-7min。
5、脫水、透明：
如果組織切片中有水分，則光線不宜穿透，在顯微鏡下不能觀察到組織的結構，所以必須脫水。透明劑可以提高組織的折射系數。這樣就可以在顯微鏡下進行觀察。
在70%、80%、90%酒精中每級各浸3-4次，再用95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ漸變酒精，每級各浸5min。在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分別透明10min。
6、封口：
從二甲苯中取出載玻片，不等二甲苯揮發，在組織切片中加入適量樹脂，上面加蓋玻片（傾斜向下）封片。
封片的目的是：（1）便於保存；（2）應用適當折射率的封片劑，使組織結構在顯微鏡下清晰顯示。
結果：細胞核呈藍色至深藍色，細胞質呈淺紅色或紅色。
作業：1.為什麽生物體的組織要經過如此繁瑣的步驟才能被觀察到？
2、查閱文獻，哪些文章使用了石蠟包埋切片和H.E.染色？
3、通過查閱文獻，談談石蠟包埋切片和H.E.染色的用途。