先單獨加入NaOH溶液是為了營造壹個堿性環境，在堿性環境下雙縮脲試劑B中的Cu2+與蛋白質肽鍵絡合產生顏色反應。
如果先將雙縮脲試劑A與雙縮脲試劑B混合，即NaOH與CuSO4溶液混在壹起，那麽就會產生Cu(OH)2沈澱，藥劑就會失去作用，看不到效果，也就無法判斷是否存在蛋白質。
雙縮脲試劑B的成分是硫酸銅的質量分數為0.01 g/mL的水溶液。先將雙縮脲試劑A加入組織樣液，搖蕩均勻（必須營造堿性環境），再加入雙縮脲試劑B，搖蕩均勻。
如果組織裏含有蛋白質，那麽會看到溶液變成紫色。具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆可與雙縮脲試劑產生紫色反應。蛋白質的肽鍵在堿性溶液中能與Cu2+絡合成紫紅色的化合物。顏色深淺與蛋白質濃度成正比。
擴展資料：
雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出壹個分子氨後得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與二價銅離子形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以壹個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。
紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。幹擾這壹測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。
此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及幹擾物質少。主要的缺點是靈敏度差，不適合微量蛋白的測定。
百度百科-雙縮脲法