· 標本制備恰當，是免疫組化成功的首要條件
· 免疫組化對組織和細胞標本的要求
– 保持所檢標本原有的結構、形態；
– 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。
· 免疫組化的組織和細胞標本，制作流程與常規處理方法基本相同，但對組織、細胞的處理又有其特殊要求及註意事項。
– 各種抗原由於其含量及特性的差異對標本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用於本實驗的最佳方法。
免疫組化中常用的組織和細胞標本
· 組織標本
– 石蠟切片
– 冰凍切片
· 細胞標本
– 組織印片
– 細胞培養片(細胞爬片)
– 細胞塗片 · 石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法
– 最大優點是組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；
– 石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。
· 石蠟切片制作過程對組織內抗原顯現有壹定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數免疫組化中首選的組織標本制作方法。
1、取材的特殊要求及註意事項
· 標本新鮮：壹般在2h以內進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴重彌散。
· 取材部位：除取病竈或含待檢抗原部位外，還應取病竈與正常交界處，即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區，以形成自身對照。
– 細胞壞死後，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，幹擾觀察，因此取材時應盡可能避開壞死區。
1、取材的特殊要求及註意事項(續)
· 避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態改變並加深非特異著色，因而取材時應使用鋒利的刀刃；
– 鑷取組織動作要輕；
– 經窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結果時應有所考慮。
2、固定及常用的固定液
· 取材後的組織需立刻投於固定劑中
– 固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態；
– 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。
· 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬於醛類和醇類。其固定原理不同，各有優缺點。
– 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
– 醇類（常用乙醇）
– 其它 （丙酮）
(1) 醛類
· 甲醛(福爾馬林)應用最廣
– 原理：形成分子間的交聯，影響蛋白構型而使之固定。
– 優點：形態結構保存好，且穿透性強，組織收縮少。
– 缺點：
· 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；
· 醛基與抗原蛋白的氨基交聯形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構象出現空間障礙；
· 分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。
– 註意事項：
· 縮短固定時間，降低固定溫度(4?C)，為此組織塊不宜過厚。
· 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10%甲醛固定液，減少固定液pH的變化。
· 固定後充分水洗以減少分子間交聯。
· 切片在作免疫組化染色前，先經預處理使抗原再現(抗原修復)。
· 戊二醛：
– 穿透性強，微細結構保存好，但對抗原有壹定影響，常與其他固定劑聯合用作免疫電鏡固定液。
· 多聚甲醛(常用4%)：
– 可用於免疫電鏡；也可用於免疫熒光染色。
· 主要檢測組織內壹些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。
(2) 醇類
· 最常用的醇類固定劑是乙醇。
– 其固定作用：使細胞內蛋白、糖類發生沈澱。
– 優點：穿透性強、抗原性保存好。
– 缺點：
· 脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)。
· 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定後可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。
(3) 其它固定劑
· 丙酮：
– 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用於組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修復——原因
· 常規的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：
– 抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；
– 蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。
· 要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。
3、抗原修復——方法
· 化學方法
· 加熱方法
– 水浴加熱法
– 微波照射法
– 高壓加熱法
– 酸水解法
(1) 化學方法
· 主要是通過壹些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
– 胰蛋白酶：壹般使用濃度為0.05%～0.1%，消化時間為37?C，10～40min，主要用於細胞內抗原的顯示；
– 胃蛋白酶：壹般使用濃度為0.1%～0.4%，消化時間為37?C、30～180min，主要用於細胞間質抗原的顯示。
· 例如：Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加熱法
· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續10～15分鐘。
– 優點：操作簡單、經濟，適用於所有的實驗室，
– 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。
(3) 微波照射法
· 將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續l0～15分鐘，冷卻後，按免疫組化染色步驟進行。
· 此方法由於微波場內極性分子、離子高速運動，撞擊交聯的網鏈，使抗原異常的構想恢復正常，且因分子運動產熱、效率高、時間短，對抗原再現效果好。
(4) 高壓加熱法暴露抗原
· 將玻片浸入抗原修復液內，置高壓鍋中高壓2～3min，可取得極好的效果。
· 由於高壓下受熱均勻，特別使用於大批量標本的染色。
(1) 酸水解法
· 酸水解可使交聯斷裂、暴露抗原。
· 將玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)。
· 此法能增強特異性染色，降低背景，但需註意水解過度將破壞抗原性及形態結構。
加熱法的註意事項
· 達到規定的溫度(92～95?C以上)；
· 維持壹定的時間；
· 避免切片幹涸 (抗原可能完全丟失)；
· 加熱後必須經過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復天然構型；
· 修復液：
– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液；
– 最新研究表明堿性修復液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩沖液(pH8.0)。
4、載玻片的處理
· 抗原修復過程中，由於高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。
– 新載玻片上有油汙，要用洗液浸泡12～24h，自來水沖洗後再用蒸餾水清洗；用綢布擦幹或烤箱烤幹。清潔的載玻片再用粘附劑處理。
· 常用的粘附劑有：
– APES（3-氨丙基三乙氧基矽烷）
– Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸）
– 鉻明膠溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基矽烷
· 現用現配。用純丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);
· 將洗凈的玻片浸於此液中20～30秒鐘；
· 取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結合的APES，置通風櫥中晾幹或60?C烤箱烤幹。
Polv-L-Lysine (多聚賴氨酸)
· 將清潔玻片浸於100?g/ml(10%w/v)的多聚賴氨酸溶液中(去離子水稀釋)，37?C放置30min，然後60?C烤箱烘烤1h或室溫過夜幹燥。裝盒備用。
鉻明膠溶液
· 試劑：鉻明礬(chrome alum) 0.25g
明膠(gelatine) 2.5g
蒸餾水 500ml
· 先將鉻明礬溶解於40?C少量蒸餾水中，再加入明膠及蒸餾水，可在70 ?C水浴中使明膠溶化，攪拌均勻後，即可使用。如有殘渣，可過濾後再用。
· 用時稍加溶化，切片浸入2～3min，過夜晾幹。 · 冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接切片。
· 在切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程。
– 縮短了制片時間
– 抗原性不受損失
· 對穩定性差的抗原，如淋巴細胞表面抗原尤其適合。
· 組織凍結過程中，細胞內、外的水分會形成冰晶，凍結的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴重影響組織、細胞的形態結構。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。
1、冰凍組織塊的常用方法
· 液氮中冰凍：組織投入液氮中 (壹196?C)中10～20sec；
· 幹冰中加入丙酮(或異戊烷)，液體立即氣化起泡，溫度降至壹70?C ，將組織投入，若在幹冰丙酮中置壹盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內結凍則更好；
– 上述組織在速凍時應浸埋於OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內，以保護組織。
– 制成凍塊後若需保存，應以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存於-70 ?C冰箱。
2、切片
· 供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，並有連續性。
· 載玻片也應清潔無油汙，但壹般無需塗抹粘附劑；
· 切片時，使用恒溫冷凍切片機，在箱內溫度-25 ?C 。切片厚度壹般為4～8?m。
3、切片後處理
· 切好的冰凍切片，室溫下自然晾幹1～2h後，入4?C丙酮固定10min，待幹燥後作免疫組化染色或封存於-20℃。
· 冰凍切片由於切片技術要求較高，不易得到連續性很好的切片，其形態結構亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便於長期貯存，因此冰凍切片的應用受限。 · 貼壁細胞培養時，置蓋片於培養瓶中，使細胞在蓋片上生長，達適當密度後取出固定(丙酮-20?C固定10～20min)，再進行免疫染色。
– 蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。
– 為了防止細胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。 · 大多數細胞塗片由細胞懸液制成，包括：
– 血液、尿液、腦脊液；
– 體腔積液；
– 組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結或其他實質性組織
– 懸浮培養的細胞或貼壁細胞經消化後形成的懸液。 · 細胞塗片的方法：
– 手塗法
· 將細胞濃度調節到106/ml左右，可直接塗於載玻片上，但要均勻、不重疊。
· 圖片範圍應小於1cm直徑，以節約試劑。
– 塗片機塗片法
· 將細胞樣品制成2×105～6/ml 細胞懸液，吸取50～100?l (1～2×104～5cells) 加入塗片機內，1000rpm離心2min後細胞就均勻分布於玻片上。