問題描述:
測定物質含量的壹種方法
解析:
復方銀黃微型灌腸劑主要由黃芩(Scutellavia baicalensic Gei)和金銀花(Lonicera japonica Thunb)等藥組成，具有清熱、解毒、消炎等功效。其主要成分黃芩甙(baicalin)和綠原酸(chlorogenic acid)均具鄰二酚羥基，久置會氧化降解〔1〕,溫度可加速這壹變化過程。本文以綠原酸和黃芩甙含量為指標，根據初均速法原理〔2〕，對該制劑進行加速破壞實驗，用高效液相色譜法測定其含量的變化，建立直線回歸方程，從而求出r值及室溫有效期和活化能。
1 實驗儀器與材料
1.1 儀器
LC-8A高效液相色譜儀(日本島津)，SPD-6AV可見紫外檢測器，SCL-8A系統控制器，C-R4A數據處理機，LG15-W型高速離心機(北京醫用離心機廠)，UV-160A紫外可見分光光度計(日本島津)，電熱鼓風幹燥箱(南京實驗儀器廠)。
1.2 材料
復方銀黃微型灌腸劑(自制，批號為970201)，綠原酸與黃芩甙對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為753-8701與715-8501)，甲醇(優級純)，水(去離子重蒸水)，其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 高效液相色譜法測定綠原酸與黃芩甙的含量
2.1.1 對照品溶液的制備
綠原酸對照品溶液的制備:稱取綠原酸對照品4.3 mg，用20％乙腈溶解並定容至25 mL,即得。
黃芩甙對照品溶液的制備：稱取黃芩甙對照品9.9 mg，用50％甲醇溶液溶解並定容至25 mL，即得。
2.1.2 供試品的制備
吸取樣品1 mL於10 mL容量瓶中，加20％乙腈稀釋至刻度，再吸取0.025 mL於10 mL容量瓶中，加20％乙腈 稀釋至刻度，高速離心 (15 000 r/min，15 min)待用。
2.1.3 檢測波長的確定
取綠原酸對照溶液,以20％乙腈溶液為空白進行紫外掃描；取黃芩甙對照品溶液，以50％甲醇溶液為空白，進行紫外掃描，譜圖見圖1。綠原酸的最大吸收波長λmax為326 nm，黃芩甙的最大吸收波長λmax為280 nm。
2.1.4 色譜條件
綠原酸的色譜條件：Shim-pack CLC-ODS柱(15 cm×6.0 mm);柱溫：室溫;檢測波長：326 nm;流動相：甲醇－水－冰醋酸(22∶78∶1);流速：1 mL/min;紙速：2.5 mm/min;靈敏度：0.02AUFS。
黃芩甙的色譜條件：Shim-pack CLC-ODS柱(15 cm×6.0 mm)，柱溫：室溫;檢測波長：280 nm;流動相：甲醇－水－磷酸－三乙胺(60∶40∶0.2∶2 滴);流速：1 mL/min;紙速：10 mm/min;靈敏度：0.02 AUFS。
圖1 黃芩甙與綠原酸的紫外吸收譜圖
Fig.1 Baicalin and chlenic acid UV spectrum
——:黃芩甙Baicalin；……:綠原酸Chlenic acid.
圖2 黃芩甙與綠原酸對照品色譜圖
Fig.2 Baicalin and chlenic acid collator chromatogram
a:綠原酸Baicalin; b:黃芩甙Chlenic acid.
圖3 樣品色譜圖
Fig.3 Sample chromatogram
a:綠原酸Baicalin;b:黃芩甙Chlenic acid.
2.1.5 標準曲線的制備
2.1.5.1 綠原酸標準曲線的制備
分別取綠原酸對照品溶液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL於10 mL容量瓶中，加20％乙腈至刻度，高速離心(15 000 r/min，15 min)，按上述色譜條件進樣，進樣量20 μL，色譜圖見圖2，以進樣量為x軸，峰面積為y軸，繪制標準曲線。其回歸方程為y＝188 186.046 5x－1 914, r＝0.999 9，表明綠原酸對照品在0.086 μg～0.43 μg範圍內具有良好的線性關系。
2.1.5.2 黃芩甙標準曲線的制備
分別取黃芩甙對照品溶液0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.07 mL、0.09 mL，各用50％甲醇溶液稀釋至1 mL，在上述色譜條件下，各以15 μL進樣測定峰面積，色譜圖見圖2；以進樣量為x軸，峰面積為y軸，繪制標準曲線。其回歸方程為y＝2 413.075＋2.041 028×105x，相關系數r＝0.999 7。表明黃芩甙對照品在0.059 μg～0.53 μg範圍內具有良好的線性關系。
2.2 初均速加速破壞法實驗
2.2.1 方法〔2〕
取復方銀黃微型灌腸劑4支(每組)，置電熱鼓風幹燥箱內經下述不同溫度及時間進行恒溫加速破壞實驗(見表1)，到時間後立即取出用冷水冷卻至室溫，終止反應。分別將每組的樣品打碎混勻，用HPLC測其綠原酸與黃芩甙含量。
2.2.2 測定結果
數據處理的數學模型為以綠原酸和黃芩甙的初始濃度為Coj,將在不同溫度(Ti)和相對應時間(ti)時所測濃度分別轉換成殘存率(表1)；色譜圖見圖3。按下式計算不同溫度下的初速度〔2〕
Voj＝(Coj－Cij)/ti
式中Coi、Cij分別為綠原酸和黃芩甙在室溫下與不同實驗溫度下的濃度；ti是與溫度相對應的恒溫時間(h)。〔j＝1(綠原酸)、2(黃芩甙)；i＝1,2,3,…,m〕
以lgvoj對1/T回歸，得直線回歸方程lgvoj＝a＋b/Ti和直線相關系數r,再根據Arrhinius公式lgvoj＝〔－E/(2.303×RTi)〕＋lgA，式中R為氣體常數，R＝1.987卡.度-1.克分子-1求出活化能E。
由直線回歸方程求出室溫(298 K)下的lgv298K，由反對數求得v298K。
由Voj＝(Coj-Cij)/ti求出室溫貯存期，即計算T＝298 K時100％-C％＝10％時的時間t，得。
綠原酸數據處理結果：lgvo1＝19.824 237-6902.652 72 1/T ，｜r｜＝0.991 8，E＝31.58 696 KCal/mol，V298K＝4.581 137×10-4h-1，＝2.49年。
黃芩甙數據處理結果：lgvo2＝20.727 948-7129.837 18 1/T ，｜r｜＝0.985 5，E＝32.626 57 KCal/mol，V298K＝6.343 36×10-4h-1，＝1.80年。
表1 加速破壞實驗數據
Table 1 Initial-uniform breaking velocity test data
恒溫時間
Thermostatic
time ti
(h) 溫度
Temperature
Ti
(K) 綠原酸含量Ci1
Chlenic
acid content
(%) 黃芩甙含量Ci2
Baicalin
content
(％)
1 363 93.93 89.08
2 358 94.61 90.96
3 353 95.03 91.87
4 348 95.30 90.53
5 343 96.55 93.35
6 338 97.89 96.32
7 333 99.12 98.26
8 328 99.66 99.28
9 323 99.76 99.75
3 討論
金銀花和黃芩是銀黃微型灌腸劑中的主要藥物，綠原酸是金銀花中比較明確的有效成分之壹，黃芩甙是黃芩中比較明確的有效成分之壹，因此本文以綠原酸和黃芩甙的含量變化為指標。
待測組分與雜質在本文色譜條件下達到良好的分離效果，所得回歸方程滿意。表明，應用高效液相色譜法測定銀黃微型灌腸劑中主要成分綠原酸和黃芩甙的含量變化是可行的。
采用初均速法測定的綠原酸和黃芩甙活化能數據與文獻〔4〕報道27.4 Kcal/mol、27.0Kcal/mol相近，表明預測的有效期可作為控制該制劑質量標準的壹個參考數據。