1局部隨機摻雜法
將待突變的目的基因克隆在載體質粒的特定位點上，其上遊接兩個限制性位點RE1和RE2，分別能產生5’和3’突出的單鏈粘性末端。利用大腸桿菌核酸外切酶III末端特異性降解RE1和RE2切割的重組質粒3’凹端，新生成的單鏈區域大小由酶解反應時間控制(單鏈區域越短，突變準確率越高)。終止反應後，用Klenow酶填充單鏈區域。除了四個正常的dNTP，底物還包括壹個具有特殊結構的脫氧核苷酸類似物，它在缺口填充過程中被整合到壹個或多個DNA鏈中。隨後，用S1核酸酶處理單鏈末端，並用T4-DNA連接酶連接成環。在體內復制過程中，由於類似物的非特異性堿基配對，50%的擴增產物被引入錯配堿基，導致位點突變。這種方法產生的突變體壹般含有幾對取代堿基，突變的區域取決於核酸外切酶III末端的降解程度。
2基定點轉換方法
最簡單的可以導致定點堿基轉換的方法是使用壹些化學試劑在體外突變DNA分子。通常，待突變的質粒DNA或DNA片段用誘變劑處理，並轉化到大腸桿菌中以構建突變文庫。體外最常見的誘變劑是亞硫酸氫鈉，在單鏈DNA的情況下，它可以特異性地將胞嘧啶殘基脫氨形成尿嘧啶殘基。處理過的單鏈DNA在體外被DNA聚合酶轉化為雙鏈結構，在復制過程中原始DNA分子上的CG堿基對被轉化為TA堿基對。從表面上看，這種方法引入的突變不是定點的，但如果適當控制誘變劑的處理條件，每壹個DNA單鏈分子只能含有壹個轉換的堿基，其位點是隨機分布的，這樣就可以從樣本龐大的突變體庫中篩選出在預期位點突變的重組分子。
除了上述化學誘變，DNA分子的所有可能的堿基對轉化都可以通過酶促合成來進行。其原理是在不理想的反應條件下，如更高或更低的離子強度、四種核苷酸底物濃度不平衡、3’至5’缺乏核酸外切酶活性的DNA聚合酶(Taq)等，在體外復制單鏈DNA。在體外DNA聚合系統中，如果壹種核苷酸底物的濃度太低，當模板需要時，它可能被其他三種底物取代，導致序列突變。
三部分片段合成法
如果待突變位點的上下遊都有合適的限制性內切酶識別序列，特別是當多個待突變位點集中在這個區域時，我們可以考慮直接合成這個片段，在這個過程中設計待突變的堿基，然後用人工合成的寡核苷酸片段替換重組質粒上相應的待突變區域，從而完成基因的定點突變。部分片段合成法特別適用於系統地改變功能蛋白質的氨基酸序列，在體內觀察突變位點對蛋白質生物學功能的影響，從而確立這些氨基酸殘基在突變前對蛋白質結構和功能的貢獻。例如，在大腸桿菌噬菌體433和P22阻抑蛋白分子中，？螺旋角？用上述方法研究了螺旋結構域與操縱基因DNA的結合特性。
4引物定點導入法
引物定點導入本質上是壹種寡核苷酸介導的定點誘變方法，可以直接在克隆的基因中產生各種點突變和區域突變。首先將待突變的目的基因克隆到M13-RF DNA載體上，轉化大腸桿菌，選擇重組空斑分離重組DNA的正鏈。人工合成與待突變區域互補的寡核苷酸引物，在此過程中設計並引入突變的堿基，然後在溫和條件下與重組DNA的正鏈退火。DNA體外復制連接後，雙鏈分子再次轉化大腸桿菌。以合成的寡核苷酸片段為探針，在嚴格的條件下(如提高雜交溫度5-10℃)，篩選含有突變堿基的空斑，分離純化RF DNA雙鏈分子，用於克隆和表達。同樣，為了在DNA的特定位點插入或刪除壹個片段，我們也可以設計和合成具有特殊結構的寡核苷酸引物，並將其引入待突變的區域。然而，應該註意的是，要插入或缺失的DNA片段應該小於引物本身的長度，否則退火操作相當困難。
理論上，DNA體外復制克隆後，攜帶突變堿基的空斑數量應該是重組空斑總數的壹半，但由於技術原因，這壹預期空斑通常只有1 ~ 5%。為了特異性富集突變體，便於篩選，可以將待突變的重組M13-RF DNA分子轉化到具有兩種DNA代謝酶基因缺陷dut和ng的大腸桿菌受體菌株中。前者不能合成dUTP水解酶，導致細菌細胞內dUTP含量急劇增加。當在DNA中復制時，dUTP部分取代dTTP，並整合到DNA新生鏈中。後者是尿嘧啶糖基化酶的基因缺陷，這種突變體失去了去除DNA鏈中脫氧尿嘧啶核苷酸殘基的能力。該菌株產生的重組M13 DNA正鏈分子中約1%的T被u取代，體外復制後，將雙鏈DNA分子導入正常大腸桿菌受體細胞。此時，該菌株的尿嘧啶N-糖基化酶從DNA鏈上去除脫氧尿嘧啶核苷酸殘基，降解原始模板鏈，而突變鏈由於不含u。
5 PCR擴增突變法
將待突變的靶基因克隆到載體質粒上，並將重組分子分入含有兩種不同引物的反應管A和B中。在試管A中，引物I與克隆基因的區域互補，只含有壹個錯配的堿基(即突變位點)，而引物II與載體區域完全互補，這樣兩條引物的末端都位於待突變位點的右側；在試管B中，兩條引物都與克隆的基因互補，但引物III含有錯配的堿基，引物IV完全互補，兩條引物的末端位於待突變位點的左側。經過幾輪PCR擴增，積累的雙鏈DNA產物都是線性平頭分子。管A和管B的擴增產物混合變性退火後，只有I-III和II-IV雜合雙鏈具有交叉缺口環結構，並含有突變位點，可直接轉化大腸桿菌，無需連接，而其他組合的雜合雙鏈為線性分子，通常很難形成克隆。