腦缺血屬於中風範疇，是臨床常見病，具有發病率高、死亡率高、致殘率高的特點，嚴重危害人類健康。迄今為止，國內外仍缺乏治療腦缺血及其後遺癥的有效化療藥物。循證醫學表明，中醫藥治療缺血性中風具有壹定優勢。目前，大量研究集中在中藥對急性腦缺血損傷的保護作用。但是腦缺血後的功能恢復是壹個漫長的過程，長期以來對其研究很少。補陽還五湯是治療缺血性中風及中風後遺癥的經典方劑，出自清代王清任的《醫林蓋草》。該方臨床應用廣泛，療效確切，但其促進神經功能恢復的機制有待進壹步闡明。本文采用大腦中動脈閉塞法復制大鼠局竈性腦缺血模型，探討補陽還五湯對其神經功能的長期保護作用，以期為缺血性中風的臨床用藥提供實驗依據。
1材料
1.1動物健康雄性SD大鼠，189，SPF級，體重260 ~ 280 g，購自湖南省斯萊克京達實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK(湘)2009-0004，動物合格證號004535。
1的處方。2補陽還五湯出自王清任《林逸蓋厝》，由黃芪120 g，赤芍4。5 g，川芎3 g，歸尾6 g，幹地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，藥材均符合中國藥典2005年版。補陽還五湯制備:將飲片用清水浸泡30 min，第壹次煎煮時加入藥材和5倍量的雙蒸水，煎煮60 min，第二次煎煮時加入5倍量的雙蒸水，煎煮60min，將兩次煎煮液混合均勻，濃縮至含生藥2g·mL-1，冷藏備用。
1.3試劑10%水合氯醛(揚州奧鑫助劑廠)、多聚甲醛(長沙錦華化工有限公司)、TTC(適馬紅四唑公司)。
1.4儀器Bx51光學顯微鏡和IPP5。1圖像分析系統(日本奧林巴斯)、FA電子天平(上海泰之恒電子衡器有限公司)、全自動雙純水蒸餾器(上海玻璃儀器壹廠)、Finesse 325切片機(英國山道)。
2種方法
2.1分組及給藥大鼠隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組，每組63只。每組動物分為三個時間點，即首次給藥後7，14，21天，每個時間點21只動物。補陽還五湯組動物術後2小時開始服藥，劑量為5g·kg-1d-1，ig 1次，每日1次。模型組和假手術組給予等體積蒸餾水。
2.2模型制備與評價參考文獻:大腦中動脈閉塞復制局竈性腦缺血大鼠模型:10%水合氯醛(3±3。5 mL kg-1) ip麻醉。頸部正中切口約3cm長，逐層分離，結紮頸外動脈，夾閉頸內動脈，然後結紮頸總動脈，約在頸總動脈分叉下方。假手術組僅切開皮膚，分離左側頸總動脈後縫合。手術後，將動物放入墊有幹凈填充物的飼養箱中，它們可以自由飲水和進食。清醒2小時後，根據Longa和Bederson的五分法對動物進行評分，得分為1 ~ 3者入組。0:無神經損傷癥狀；1分:對側前爪不能完全伸出；2分:轉向對面；3分:向對面傾倒；4分:無法自主行走，意識喪失。分數越高，神經功能缺損越嚴重，反之亦然。排除標準:分數低於1；蛛網膜下腔出血；HE染色顯示無腦缺血病理改變；在時間之前死去。死亡等動物不足時隨機替換。
2.3指標檢測
2.3.用1 TTC染色法測量每組5只大鼠在各時間點的腦梗死面積比。10%水合氯醛麻醉後，斷頭取腦，於-20℃冷凍20 min，距額極每2 mm切1片。1刀在大腦前極與視交叉連線的中點；第二刀在視交叉；第三把刀在漏鬥柄處；第四刀在漏鬥柄和後葉尾極之間，用***A、B、C、D、e 5片，用2%紅色四氮唑染色，37℃避光30 min，正常組織為暗紅色，梗塞組織為白色。拍照後選擇最大缺血切片C的梗死面積，用Image-Pro Express圖像分析系統掃描計算，表示梗死面積占C切片總腦面積的百分比。為了消除梗塞半球腦水腫造成的誤差，用Swanson法校正後計算C切片上梗塞面積的百分比。is =(s 1-Sr)/2s 1×100% s 1:C片健側總面積；Sr:C片患側非梗死區面積。
2.3.②神經功能評分:各時間點每組大鼠10，術後2小時和動物處死前1小時進行神經功能評分。
2 . 3 . 3 HE染色觀察海馬和皮質的組織病理學變化，每個時間點每組6只。用和2壹樣的方法。3.1，4%多聚甲醛取腦背面固定24 h，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，腦連續切片(厚度5微米)，含海馬的切片貼在載玻片上，he染色，光鏡下觀察並比較各組左側海馬和皮質組織細胞的形態病理變化。
2.4統計分析
所有數據均以x±s表示，數據用SPSS 19進行統計分析。0.組間比較采用單因素方差分析，P
3個結果
3.TTC染色比較1組的腦梗死面積，假手術組均勻染成深紅色。7，14，21 D模型組和補陽還五湯組染色不均勻，局部梗死區呈白色，梗死區在缺血的頂葉皮質和海馬周圍。梗死面積分析顯示，模型組和補陽還五湯組梗死面積隨時間推移逐漸減小(P
3.2各組神經功能評分在各時間點假手術組均為0分；補陽還五湯組神經功能評分低於模型組，差異有統計學意義(P < 0)。05) 。
3.3各組海馬和皮質的形態學變化
3.3.1海馬假手術組形態正常，細胞輪廓清晰，核染色均勻，細胞排列有序，間質染色均勻。7，14和21 d模型組海馬神經元皺縮，細胞核固縮，核邊緣嚴重，細胞內出現空泡，細胞形態由橢圓形變為梭形和三角形，細胞間距增大，間質染色稀疏，有孔洞。7、14、21 d補陽還五湯組與模型組相比，海馬內空泡樣細胞數量明顯減少，細胞形態明顯改善，細胞排列較模型組更為有序。7，14 d補陽還五湯組仍有少數細胞核染色深，呈空泡樣改變，但補陽還五湯組海馬細胞形態接近假手術組。
3.3.2皮質假手術組皮質細胞形態正常，邊緣清晰，排列整齊，形態完整，細胞核及細胞間質染色均勻。7、14、21 d模型組缺血細胞出現空泡樣壞死，細胞形態喪失，細胞間隙增大，染色變淺，呈網狀改變；殘存細胞體積縮小，細胞核濃縮染色深，細胞界限不清。與同時期模型組相比，補陽還五湯組皮質細胞內空泡樣細胞數量明顯減少，細胞形態明顯改善，細胞排列整齊，細胞核更清晰，細胞間隙染色更均勻。
4討論
局竈性腦缺血又稱缺血性卒中，是腦血管疾病最常見的臨床類型，是由於腦的血液供應發生障礙，導致腦組織缺血缺氧，導致相應區域的腦梗死壞死，大量神經元喪失，產生相應的神經功能缺損癥狀和體征。目前西醫治療腦缺血的方法主要有溶栓、抗凝、降纖、擴血管、高壓氧、介入治療、基因治療、神經幹細胞移植等，尚處於動物實驗階段。在這些治療方法中，除了超早期(發病3小時內)溶栓治療有效率高達21% ~ 93%，其他治療方法效果不確定。而且，由於其嚴格的時間窗，溶栓治療意味著只有不到5%的患者有機會做這種治療。因此，約80%的缺血性腦卒中患者會留下不同程度的後遺癥——神經功能缺損。
典型的缺血性中風根據病程可分為三個階段。急性期1，中風後1個月內；第二恢復期，中風後2 ~ 6個月內；3期後遺癥，中風後6個月。補陽還五湯主要用於腦缺血恢復期及後遺癥期的治療，是治療腦缺血後遺癥的首選藥物，臨床應用療效顯著。所以在動物實驗中，最長的觀察時間是缺血後21 d，相當於人腦缺血的後遺癥。本實驗研究中，神經功能評分結果顯示補陽還五湯能促進腦缺血後大鼠神經功能的恢復。其作用機制被學者認為是促進血管生成，擴張血管，抗凝溶栓改善腦缺血局部微循環，減輕腦水腫和氧自由基損傷，保護腦組織，從而促進神經功能的恢復。本實驗室及國內其他實驗室的研究表明，補陽還五湯能促進缺血後腦內神經幹細胞的增殖、遷移和分化，這可能是其促進缺血後神經功能恢復的機制之壹。通過比較各組動物的腦梗死面積的比值，結果顯示補陽還五湯組的腦梗死面積明顯小於同時期模型組。可能的原因有:壹、補陽還五湯在急性腦缺血時對大腦起保護作用，抑制大量神經元死亡和雕亡，使梗死面積變小；其次，補陽還五湯促進缺血後腦組織的再生、修復和代償，導致梗死面積比相應模型組小；也有可能兩者兼得。此外，通過比較補陽還五湯組與模型組缺血後海馬和皮質的組織學變化，結果表明補陽還五湯能明顯改善腦缺血損傷後細胞形態和排列，促進組織修復。
總之，本研究證實了補陽還五湯具有降低腦缺血神經功能評分、減少腦梗死面積、改善腦組織細胞形態和排列的腦保護作用，為該藥臨床治療缺血性中風提供了有力的實驗依據。
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