(2)佐劑和乳化:佐劑可以幫助抗原在註射部位緩慢釋放，從而增加免疫刺激的效果。佐劑可分為完全佐劑和不完全佐劑。完全佐劑中加入滅活的分枝桿菌(如卡介苗)或棒狀桿菌。弗氏佐劑可從試劑公司購買或由羊毛脂和石蠟油以1: 2-4的比例混合而成。將佐劑和抗原按照1: 1的比例混合乳化成均勻的乳液，保存後不會出現油水分離。
(3)免疫動物:豚鼠、家兔、小鼠、大鼠等。通常用於制備抗血清。如果能大量生產動物，如羊、馬等，則待免疫動物的乳劑用量為1.0-2.0 ml小鼠，2-4 ml兔。用抗原免疫動物的方式取決於動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹部註射(I.P .)、肌肉註射(I.M .)、皮內註射(i.d .)和皮下註射(s.c .)適用於任何抗原。這些途徑主要是刺激局部淋巴結的免疫反應，初次免疫和加強免疫都可以。靜脈註射(I.V .)只適用於可溶性抗原和分散的單細胞懸液，不能使用佐劑，其誘導的免疫反應主要發生在脾臟。此外，在單克隆抗體的制備中，也可以采用直接註射脾臟或體外免疫的方法，特別是對於微量抗原。體外免疫方法也常用於制備人單克隆抗體。體外免疫，將脾細胞或外周血淋巴細胞(包括B細胞、T細胞和抗原提呈細胞)與抗原體外培養，然後與骨髓瘤細胞融合。初次免疫後，需要加強免疫2-3次以上，以保證能形成高水平的IgC抗體。壹般兩次免疫註射的時間間隔為3-4周，適用於大多數動物。小動物的話，區間可以是10-14d，大動物的話，大概是2月左右。在最後壹次註射免疫增強劑後壹周內收集抗血清可獲得高水平的抗體。(1)采血:加強免疫2-3次後，可從耳靜脈或眼球(小鼠)采血，測定抗血清效價。當效價達到理想高度時，就可以采血了。血液可以直接取自心臟或通過動脈。血液凝固後，用註射器或吸管吸出血清。
(2)抗血清的純化和保存:除抗體外，血清中還含有許多其他蛋白質成分。為了避免這些蛋白質幹擾抗體(免疫球蛋白)標記反應和抗原抗體反應，可以純化抗血清以獲得單壹生物(通常是IgG)組分。純化IgG常用的方法有飽和硫酸銨鹽析法和色譜法。蛋白質在不同鹽濃度的溶液中溶解度不同。鹽離子幹擾蛋白質與水分子形成氫鍵，因為水鹽結合比水蛋白結合更穩定，蛋白質可以從溶液中沈澱出來。蛋白質分子越大，沈澱所需的鹽離子濃度越低。免疫球蛋白(Mr 1.5×105)遠大於血清中的主要蛋白白蛋白(M r 6.7×104)。抗體在30%-50%飽和度的硫酸鹽中沈澱，白蛋白在70%-80%飽和度沈澱，所以通常用33%飽和度。為了減少抗體變性，鹽析要在4℃進行，抗血清要用pH8.0緩沖液稀釋，以減少* * *因蛋白濃度過高而沈澱。銨鹽的溶解度不隨溫度的變化而明顯變化。0℃和25℃相差只有3%，而鈉鹽相差5倍。因此，銨鹽常用於低溫沈澱，鈉鹽常用於室溫沈澱。銨鹽會幹擾抗體的標記反應(如FITC和生物素標記)。
鹽析法只能部分純化抗體，通過層析可以制備純度更高的抗體制劑。IgM五聚體的相對分子量為9.7×10，比血清中其他任何蛋白質都大。它可以很容易地通過分子篩色譜純化。IgG在PH 8.0時帶負電，能與DEAE纖維素上的陽離子結合，所以可以用離子交換層析純化。親和層析是純化IgG最常用的方法。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白有很高的親和力，可以被這兩種蛋白交聯的親和層析柱純化。大多數IgG與蛋白A的結合PH為8-9，洗脫PH為2-4。而與G蛋白的結合PH為5-7，洗脫PH為9-10。蛋白C更適合IgG的純化。反應條件為溫和的弱酸性或弱堿性，與IgG的結合力高於與蛋白A的結合力..G蛋能與大多數動物物種的IgG結合，但A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和羊IgG結合能力弱或不能與G蛋白和A蛋白結合，不能與雞IgG結合。
抗血清或純化抗體可在低溫下保持活性數年。反復凍融會使抗體迅速失活，被細菌或黴菌汙染的抗血清或IgG制品也容易失去活性。加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA，稀釋後的抗血清可在4℃保存。長期儲存的等量甘油通常冷藏在-20℃以下。也可保存在4℃的50%飽和硫酸銨中或凍幹。不同目的制備的抗血清對其中所含抗體的濃度、特異性和免疫球蛋白類型有不同的要求。為了獲得符合質量和數量要求的抗血清，在收集動物血清前必須對其免疫效果進行檢測，並對收獲的抗血清進行壹些參數分析，如效價、親和力、交叉反應等。根據不同的抗原特性選擇合適的檢測方法。最常用的方法是免疫沈澱、ELISA和放射免疫測定。
效價又稱效價，是壹種半定量指標，常用來表示抗血清中特定抗體的相對含量，即在給定條件下結合-定量抗原的抗血清的稀釋度。抗血清經過壹系列稀釋(如多倍稀釋)後與定量抗原反應，抗血清的效價為可檢測到的最大稀釋倍數。不同的檢測方法在測定同壹份抗血清的效價時，靈敏度不同，抗血清的效價也不同。比如沈澱反應(瓊脂雙擴散)的效價和ELISA的效價相差很大，後者遠遠高於前者。放射免疫分析常用來標記小分子抗原，以檢測抗血清的效價。
親和力表示抗血清與相應抗原的結合強度，是描述抗體異性的重要指標。
常用親和常數k親和常數k與抗原抗體反應的平衡常數有關:
抗體特異性和交叉反應:抗體是特異性的。它只與相應的抗原反應。而實際制備的抗體往往會出現非特異性反應，這是由於抗原不純造成的。如果多組分抗原之間存在* * *相同的抗原決定簇，或者如果兩個抗原決定簇在結構上相似並能結合同壹抗體，則抗體和異源抗原之間會發生交叉反應。利用瓊脂雙擴散可以簡單直觀地反映不同抗原與同壹抗血清之間，或不同抗血清與同壹抗原之間的交叉反應。原理1:單克隆抗體(MAb)和抗血清(也叫多克隆抗體，PAb)的主要區別在於，MAb是由單個B細胞克隆產生的均壹的免疫球蛋白分子。因此，單克隆抗體是B細胞克隆的標誌，是壹種獨特的抗體，其特異性針對的是壹個抗原決定簇。單克隆抗體的制備不能用化學分離的方法從多克隆抗體中分離純化，但可以通過分離產生抗體的B細胞克隆獲得。為了使B細胞克隆在體外長期存活並產生完全均壹的單克隆抗體，g . k . &:Ouml；赫勒和米爾斯坦在1975中建立了雜交瘤方法。因此，制備單克隆抗體的技術也被稱為雜交瘤技術。
雜交瘤技術的基本原理是將分泌抗體但不能長期培養的B細胞與能在體外長期培養並低溫保存的腫瘤細胞雜交。篩選得到的雜交瘤細胞應是能分泌抗體、具有腫瘤細胞特征、能長期傳代培養、能在液氮中保存的細胞。克隆這些細胞，用單克隆雜交瘤細胞產生單克隆抗體。
原理:最常用的單克隆抗體是小鼠單克隆抗體，也有大鼠和人單克隆抗體。人單克隆抗體的制備是復雜的。小鼠單克隆抗體的制備通常使用Balb/c小鼠的B細胞及其骨髓瘤細胞。大鼠的單克隆抗體通常由Lou/c大鼠及其骨髓瘤細胞和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤細胞制備。從免疫動物的脾臟中分離出b細胞。動物免疫方法與抗血清制備相同，只是在脾臟制備前3天必須進行壹次靜脈註射，以保證獲得的B細胞具有較強的抗體分泌活性。許多骨髓瘤細胞系在突變和篩選後是有缺陷的。篩選標準是:①腫瘤細胞本身不產生抗體或產生壹定鏈的抗體，但不能分泌；②缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)。由於這種缺陷型腫瘤細胞的正常核酸合成途徑被氨基蝶呤阻斷，由於這些酶的缺乏，即使補充了其底物次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，核酸合成的旁路也不能起到拯救作用，導致腫瘤細胞死亡(圖7-2)。然而，在存在HAT的情況下，在HGPRT和TK的幫助下，雜交瘤細胞可以通過替代的核酸合成途徑正常合成DNA和RNA。因此，雜交瘤可以正常生長繁殖並被選擇。沒有融合的遊離B細胞只能存活3天，然後自行死亡。這就是用帽子介質選擇的原則。(1)融合:細胞雜交前，分別制備脾B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞(如SP2/0-Agl4細胞株)。在無菌條件下打碎免疫小鼠的脾臟，將B細胞懸浮於無血清培養基(壹般用RPMIl640配制)中，洗滌三次去除小鼠血清。用10%胎牛血清培養SP2/0細胞，每天更換新鮮培養基，使其在對數分裂期生長旺盛。用RPMIl640洗滌細胞2-3次，並將兩種細胞合並在同壹試管中。以50%聚乙二醇(相對分子質量:1000-1500)為助熔劑，在37℃下熔融1-2min。然後用1640培養液慢慢稀釋，再去除PEG，將細胞分散到HAT選擇性培養板中。電融合法也可用於制備單克隆抗體。雖然融合率高，但壹次融合的細胞數量少，需要特殊設備，限制了其廣泛使用。當脾細胞與骨髓瘤細胞的比例為5: 1-10: 1，融合細胞數為10-10時，可獲得滿意的結果。在37℃和5%CO2下，在40或96孔板的HAT培養基(含有10%-20%胎牛血清和HAT的RPMIl640)中培養融合細胞。在融合細胞懸液中，只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中生長，其他形式的融合細胞不能生長，未融合細胞也不能在HAT培養基中存活。
在融合後的細胞培養過程中，飼養細胞有助於雜交瘤細胞的生長。飼養細胞可以是同壹動物的腹腔細胞或胸腹細胞。腹膜細胞中的吞噬作用可以清除死亡的細胞碎片。讓背景越來越幹凈。同時，飼養細胞分泌的細胞因子或活性物質有助於雜交瘤細胞的生長。現有的商業雜交瘤細胞生長因子可用於替代飼養細胞。
(2)陽性雜交瘤細胞的篩選和單克減:雜交細胞經約10-14d培養後，形成可用的細胞集落(克隆)。在幾次更換培養基(HT培養基)後檢測抗體活性。常用的篩查方法有ELISA和凝集試驗。前者常用於可溶性抗原，後者適用於細胞、細菌等表面抗原。此外，Dot-ELISA、western blot和免疫熒光試驗均可用於篩選雜交瘤細胞。
將以混合方式生長的細胞從許多細胞克隆中分離成單細胞克隆的過程稱為克隆。最常用的單克隆方法是有限稀釋法，即將混合細胞稀釋分裝在培養板上，使培養板的大部分孔中只出現壹個細胞。為了確保抗體分泌細胞來源於單壹細胞，可以重復克隆過程，這被稱為亞克隆。除了有限稀釋法，熒光激活細胞分選(FACS)也用於雜交瘤細胞的克隆過程。應立即擴增產生特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞系，以獲得足夠的細胞用於保存和產生適用的抗體。目前，大量生產單克隆抗體常用的方法有三種:小鼠腹水制備法、大瓶培養法和中空纖維反應器法。前者多用於實驗室制備，後兩者適合工業化生產。
腹水制備:雜交骨髓瘤細胞定植於腹腔，產生大量腹水。選擇與制備單克隆抗體所用基因相同的動物品系或f1雜交品系。雜交菌株F1更適合腹水制備，若用異種動物制備腹水，可選擇無MHC限制的裸鼠。用小鼠制備腹水時，要用礦物油或降植烷致敏，抑制其免疫功能，促進腹水形成。腹腔註射10-10雜交瘤細胞，7-10 d後形成腹水，每只小鼠可獲得3-5 mL腹水，每mL含5-10 mg IgG抗體。腹水含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，並含有多種蛋白酶，容易使抗體失活。所以腹水收集後要盡快凈化，防止降解。
大燒瓶培養:使用1000mL或更多的搖瓶培養。大瓶培養上清液體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很大困難，消耗人力和培養液，增加生產成本。
中空纖維反應器:這是壹種生產單克隆抗體的經濟方法。該裝置由具有半透膜性質的微孔纖維束組成。雜交瘤細胞位於纖維外的少量培養液中，培養液在纖維的微孔中循環，補充營養，帶走廢物，使抗體大分子和小分子分離。高密度的雜交瘤細胞可以在這個系統中維持幾個月，每天可以產生幾百毫克的抗體。抗體濃度高，體積小，易於純化。
胎兒(小牛)血清壹直是細胞培養所必需的。在單克隆抗體生產過程中，培養液中的血清蛋白增加了純化抗體的難度。近年來發展起來的無血清培養技術已逐漸用於單克隆抗體的生產。鼠源單克隆抗體蛋白應用於人體後，作為抗原可引起人體免疫反應，大大降低其生物活性，並可能導致過敏反應。因此，人源單克隆抗體在臨床治療中具有廣闊的應用前景，引起了人們的普遍興趣。然而，人單克隆抗體的制備存在許多技術和倫理障礙，如人雜交瘤細胞系的不穩定性、某些抗原不能人工免疫、人B細胞只能從外周血中分離而不能從脾臟中分離等。盡管如此，還是獲得了壹些人單克隆抗體，技術也在逐步完善。
人腫瘤細胞系U-266常用於人外周血B細胞融合獲得人單克隆抗體。其他淋巴母細胞樣塗片(LCL)來源於EB病毒轉化的淋巴細胞，如GMl500、W1-L2和ARH77，它們也用於制備雜交瘤細胞。這些細胞系對ED病毒核抗原(EBNA)呈陽性，雜交瘤細胞的抗體分泌水平不高。
另壹種獲得人單克隆抗體的方法是用EBV直接轉化壹些分泌抗體的細胞，使其成為“永生”細胞進行體外培養。EBV感染人B細胞後，將病毒基因插入人B細胞的基因組中，1%的細胞轉化為“永生”細胞。b細胞轉化可以通過兩種方法實現:病毒驅動和細胞驅動。前者是用分泌EBV的B95-8細胞系培養B細胞，而後者是用EBNA陽性LCL細胞培養。“細胞驅動”轉化的b細胞相對穩定，抗體分泌能力強。
人淋巴母細胞系和人雜交瘤細胞很難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜合子制備，即EBV轉化的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，然後將獲得的異源雜交瘤細胞與免疫的B細胞融合，獲得人單克隆抗體分泌細胞，該細胞不產生自身免疫球蛋白，EBVA也為陰性。抗體的化學修飾:
抗體的Fc段與熒光素、同位素、酶、發光化合物、稀土元素、藥物、毒素等連接後。它不影響其Fab功能區與特異性抗原的結合。根據交聯物的不同性質，標記抗體可作為診斷試劑，也可作為藥物的靶向載體，將藥物或毒素導向抗原存在的部位，使藥物或毒素發揮更有效的作用，俗稱“生物導彈”。從而減少腫瘤治療過程中藥物、毒素、同位素和酶引起嚴重副作用，大大提高腫瘤治療效果。
很多毒素，如蓖麻毒素、白喉毒素、天花粉、紅小豆毒素，都是蛋白質或糖蛋白，可以用雙功能試劑與抗體連接。嗎啡、前列腺素、甲氨蝶呤、磷酸酶C等羧基可通過碳化二亞胺(EDC)和混合酸酐法與抗體的氨基形成酰胺鍵。同樣，含有脂肪胺的藥物，如慶大黴素、阿黴素，在水溶性EDC的作用下，連接到抗體的羧基上；而含有芳香胺的藥物，先在低溫下與亞硝酸反應生成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵。簡而言之，通過對抗體的化學修飾，將抗體的特異性應用於靶向給藥和定位檢測。抗體基因文庫是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達載體中，在原核細胞中表達不同的抗體，形成抗體庫。從這個抗體庫中，可以用抗原篩選相應的抗體基因。抗體基因來源於雜交瘤細胞或動物B細胞(免疫與否)的DNA和mRNA。
用質粒作為抗體庫的載體，雖然可以表達活性抗體分子或片段，但用線性噬菌體表達更方便有效。M13、fd和F1的外殼蛋白由五種蛋白組成:Pⅲ、P ⅵ、P ⅶ、P ⅷ和P ⅸ。每種蛋白的含量不同，其中pⅷ最多，每個噬菌體有2700個pⅷ亞基，其他4種蛋白只有5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度不影響噬菌體的組裝，抗體以融合蛋白的形式表達在噬菌體表面。常用的噬菌體表達質粒有FD-cat 1、FD-Tet-dog 1、PHEN1、pComb3和pComb3H。Pⅲ和P ⅷ常用於抗體融合蛋白的構建，高拷貝數、低親和力的抗體蛋白容易被篩選出來。
噬菌體表達抗體時，往往不表達完整的抗體分子(因為糖基化不能在CH2上進行)。根據不同的引物，獲得了重鏈的VH或VHCH1區和輕鏈的VL或VLCL區。VL和VH通過短肽連接形成單鏈片段可變區(ScFv)。VHCH1和VLCL形成Fab片段。此外，VH和VL單獨也能結合抗原。如果它們形成同源或異源二聚體(dAb)，穩定性和親和力會明顯提高(圖7-4)。此外，如果在抗體片段的DNA末端添加壹些功能蛋白(如堿性磷酸酶、蛋白毒素)的基因，表達的抗體會具有壹定的生物活性功能片段，可用於檢測或治療。如果將終止子(標簽)加到抗體基因的末端，表達的抗體片段是可溶的，而不是結合到噬菌體表面。
用特異性抗原免疫動物B細胞構建的抗體噬菌體文庫親和力高，但用不同於免疫抗原的抗原篩選的抗體親和力普遍較低。可以通過模擬自然體細胞突變來提高親和力。比如雜交重組法，即將獲得的輕鏈或重鏈的V片段切掉，然後克隆到隨機文庫的V區形成二級文庫，使H鏈和L鏈混合，可以提高抗體片段的親和力。利用PCR錯配在抗體的抗原結合區引入隨機突變，也可以提高對抗原的親和力。首先在噬菌體Pⅷ中表達低親和力載體，然後通過PCR擴增抗體基因片段並在Pⅲ中表達，從而獲得高親和力的抗體片段。
抗體基因文庫有兩個優點:壹是從不適合人工免疫的物種中獲得單克隆抗體，如人單克隆抗體；其次，可以快速方便地獲得單克隆抗體。將鼠抗體的V區基因與人抗體的C區基因重組得到的嵌合抗體，既保留了鼠抗體對抗原的高親和力，又削弱了鼠抗體對人的免疫原性，提高了治療性抗體的效果。
重組嵌合抗體基因可轉化入骨髓瘤細胞或中國倉鼠卵細胞(CH0)並在其中表達。為了進壹步消除小鼠抗體V區框架區(FW)的異質性，可以進行CDR移植，獲得具有與小鼠FW相似的人FW結構的嵌合抗體。
噬菌體表達的抗體只含有V區(scFv)或Fab片段，缺少Fc區，使抗體穩定性下降，半衰期縮短，與Fc受體的結合功能消失。因此，在抗體功能片段末端連接蛋白A、酶、細胞因子、CD4、毒素等分子，不僅可以增加抗體片段的穩定性，還可以發揮壹些生物活性功能。
與化學交聯法相比，抗體基因工程法獲得的交聯抗體和效應分子具有優勢:可以大量生產，並且抗體和效應分子的活性不會受到修飾的影響，效應分子可以根據需要進行修飾。
此外，在抗體片段的末端連接壹種特定的兩親性螺旋結構，如亮氨酸拉鏈，可以使單價scFv或Fab片段在體內或體外形成穩定的雙分子聚合物，從而提高抗體片段的親和力。該方法也可用於制備雙特異性抗體。噬菌體表達的抗體片段通常在原核細胞(大腸桿菌)中完成。原核系統表達抗體片段的產量
高、低成本、快速、易操作。然而，抗體片段在原核表達系統中不能被CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此，可以將重組抗體基因片段轉移到合適的骨髓瘤細胞系或哺乳動物細胞系(如CHO)中，甚至在植物細胞中表達，獲得與淋巴細胞表達相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈、輕鏈和分泌芯片基因可以轉化到不同的植物中，表達這些蛋白的植物可以進行有性雜交，雜交後代可以組裝成完整的IgA雙分子。利用植物作為抗體表達的生物反應器已有很多成功的研究報道，比動物細胞更經濟，應用前景廣闊。抗體酶是抗原決定簇處於過渡結構的抗體。由於轉化後的分子極不穩定，無法制備抗體，因此催化抗體主要通過設計穩定的轉化類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯，免疫動物，獲得針對半抗原的抗體，篩選具有催化活性的抗體來獲得。用於篩選催化性單克隆抗體的ELISA與用於篩選壹般抗體的ELISA不完全相同，應根據催化反應的特點進行修改。經典的方法是先篩選出與底物或半抗原結合的抗體，再從中篩選出具有催化活性的抗體。這種方法費時費力。利用催化抗體對底物的催化活性，對底物進行適當的修飾，使催化反應的產物直接顯示抗體的催化活性，可以簡化檢測步驟。
過渡態類似物半抗原的設計必須了解催化反應過渡態模型的結構特征。在抗體的抗原結合位點催化形成壹些與過渡態互補的催化基團，可以穩定過渡態分子。此外，還有人通過化學修飾在單克隆抗體分子中引入壹些活性基團，提高催化抗體的催化和親和效率。噬菌體抗體庫還可用於篩選催化抗體，可省去制備過渡類似物的復雜過程，直接從帶底物的庫中篩選催化抗體片段。如果將半抗原免疫後制備的文庫或文庫進行多次混合重組，可獲得親和力更高的催化抗體。抗獨特型抗體也用於制備催化抗體。以酶為抗原免疫小鼠，獲得能封閉酶活性位點的單克隆抗體。用蛋白酶去除該抗體的Fc片段，用Fab免疫其他品系小鼠或兔，獲得的抗體具有相應的酶催化活性。
理論上，B細胞擁有全套免疫球蛋白多樣的種系基因，包括催化性自身抗體。然而，在1989中，Paul W .首先報道了壹種免疫球蛋白，它可以催化蛋白質的水解。它是壹種能水解血管活性腸肽(VIP)的Gln L6-Met 17鍵的自身抗體。以VIP為抗原可獲得具有催化作用的單克隆抗體，也可催化GLNL6-MET 17鍵。約17%的人有這種自身抗體酶，但哮喘患者體內這種抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由於VIP是壹種氣管松弛劑，有人認為這種VIP自身抗體的長期作用可能與哮喘的過敏反應有關。推測除了人工設計催化抗體，尋找自催化抗體外，還可能通過篩選單克隆抗體找到所需的催化抗體。