光緒的病情突然轉危為安，不久就去世了。名醫曲桂亭在《光緒皇帝診療秘笈》中記載，光緒死前三天，他“在床上打滾”，“對我大叫肚子疼得厲害”，面色黝黑，舌質焦黃。“這種關系和他之前的病關系不大”。光緒之死，也是宮中太監用非常規的方式處理，秘而不宣。
據說慈禧下令太監毒死他。有學者認為，由於袁世凱的背叛和告密，慈禧鎮壓了維新運動。袁世凱擔心慈禧死後光緒會怪罪於他，於是勾結清親王廢黜光緒，讓清親王的兒子當皇帝。如果失敗了，他就毒死了光緒。有學者認為光緒是病死的。政治上的挫折和長期的精神壓抑，使他患上了嚴重的神經癥，心慌、失眠、食欲不振等癥狀相繼出現。去世前壹年已是絕癥，死亡的直接原因可能是心肺功能慢性衰竭和急性感染。這種說法被大多數學者所接受。
2008年，光緒皇帝留下的壹縷頭發經鑒定後，確認其死於砒霜中毒。