動物細胞技術，有時也稱為細胞工程（Cytotechnology），是生物技術領域的壹個重要組成部分，它利用動物細胞的體外培養和擴增來生產生物產品或作為發現和測試新藥的工具。如今，這項技術已廣泛應用於現代生物制藥的研究和生產。它的應用大大減少了用於疾病預防、治療和診斷的實驗動物數量，並為疫苗、細胞簇甚至候選組織等產品的生產提供了強有力的工具。1 動物細胞技術的歷史 動物細胞技術的開端：疫苗 在疫苗工業的早期，人們經常利用動物來生產疫苗，例如用人工感染狂犬病毒的兔子來生產狂犬疫苗，用牛來生產天花疫苗，以及將某些細菌接種到動物體內來生產針對該細菌的疫苗。1920 年至 1950 年間，人們研制出了多種病毒或細菌疫苗，如傷寒、肺結核、破傷風、霍亂、百日咳、流感和黃熱病疫苗。早在 20 世紀 50 年代，就有可能利用動物細胞培養技術生產病毒。首先在反應器中大規模培養動物細胞，當細胞生長到壹定密度時，接種病毒，病毒利用培養細胞進行復制，從而產生大量病毒，這是動物細胞技術或細胞工程的真正開端。基於動物細胞技術生產的病毒疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗。1950 年至 1985 年間，細胞工程和其他技術的進步已生產出脊髓灰質炎、麻疹、流行性腮腺炎、風疹、乙型肝炎和帶狀皰疹等多種人類疫苗，以及多種獸用疫苗（表 1）。 表 1 利用動物細胞培養技術生產的疫苗 ---------------------------------------------------------------- 人用疫苗 獸用疫苗 ------------------------------------------- --------------------- 狂犬病疫苗 風疹疫苗 乙型肝炎疫苗 口蹄疫疫苗 流行性腮腺炎疫苗 脊髓灰質炎疫苗 帶狀皰疹疫苗 馬立克氏病疫苗 甲型肝炎疫苗 黃熱病疫苗 腺病毒疫苗 偽狂犬病疫苗 腦炎疫苗 麻疹疫苗 日本腦炎疫苗 犬脊髓灰質炎病毒登革熱疫苗 ------------------ ---------------------------------------------- 在動物細胞技術的早期、在動物細胞技術的早期，原代細胞通常是培養出來的，例如g.,用於生產脊髓灰質炎疫苗的細胞取自猴子的腎臟，細胞培養數天後感染病毒，擴增出大量病毒用於制備疫苗。雖然動物細胞技術的飛速發展大大減少了實驗動物的數量，提高了生產效率，但由於原代細胞的增殖能力有限，壹般只能通過簡單地增加動物數量來提高產量。而具有無限增殖潛能的細胞系的使用則使疫苗生產實現了質的飛躍。來自人體或動物體內的某些細胞在壹定條件下經過體外培養後，可以獲得無限增殖潛能，用它們來生產疫苗可以大大減少實驗動物的數量。更重要的是，動物細胞體外大量培養生產的疫苗質量可以得到保證，因為使用的細胞性質統壹，經過嚴格的安全測試，克服了動物個體差異導致疫苗質量不穩定的問題，大大降低了動物身上的病原體傳染給使用者的可能性。酶、細胞因子、抗體等生物制品也可以利用類似的細胞培養技術生產，前提條件是要有能分泌目標蛋白的細胞系。然而，在基因工程技術出現之前，細胞表達蛋白質的水平很低，導致用這種方法生產蛋白質產品的產量低、成本高，因此早期的動物細胞技術只用於生產疫苗以及少量幹擾素和尿激酶。新技術的出現和進步促進了動物細胞技術的應用。20 世紀 70 年代兩個劃時代的科學發現--基因重組技術和雜交瘤技術--極大地推動了動物細胞技術的進步及其在工業領域的應用，使動物細胞大規模培養技術在疫苗生產，特別是用於疾病診斷和治療的天然生物制劑的生產中發揮了作用。表 2 列出了利用細胞培養技術生產的產品，包括治療心肌梗塞的 t-PA、治療囊性纖維化的 DN 酶、治療貧血的 EPO、治療血友病的凝血因子 VIII 和 IX、治療癌癥和乙型肝炎等病毒性疾病的幹擾素，以及治療身材矮小的人體生長激素。動物細胞技術還用於生產單克隆抗體，用於多種疾病的診斷和治療。用於生化檢測的單克隆抗體有數千種，而利用單克隆抗體治療人類疾病是近年來生物制藥的壹個重要領域，目前已有數十種單克隆抗體藥物在進行臨床試驗。自 1986 年美國食品及藥物管理局批準第壹種單克隆抗體治療藥物 OK-T3（壹種用於器官移植治療的抗 CD3 單克隆抗體，可抑制排斥反應）以來，已有 9 種治療性單克隆抗體獲得美國食品及藥物管理局的批準。此外，壹些將病毒抗原決定簇基因轉染到宿主細胞以生產更安全、更有效疫苗的基因工程疫苗也在開發之中。表 3 列出了正在開發的產品。 表 2 通過動物細胞培養技術生產的治療用生物制品 ---------------------------------------------------------------- 生物制品 適應癥 --------------------------------------- ------------------------- 組織型纖溶酶原激活劑（t-PA） 肺栓塞和急性心肌梗塞 幹擾素-α 癌癥和乙型肝炎等病毒性疾病 幹擾素-γ 肉芽腫病、病毒性疾病加濕 丙型肝炎、癌癥 凝血因子 IX（因子 IX） 血友病 B 生長促進劑 侏儒癥 DNase 囊性纖維化單克隆抗體 Orthoclone（OK-T3） 移植排斥單克隆抗體 ReoProTM（阿昔單抗） 高危血管成形術單克隆抗體 Rcmicade（英夫利昔單抗） 局限性回腸炎、單克隆抗體 SynagisTM （帕利珠單抗） RSV 感染 單克隆抗體 Herceptin （曲妥珠單抗） 治療乳腺癌的組織工程軟骨 CarticelTM 修復軟骨組織 促紅細胞生成素（EPO） 腎病、腫瘤和艾滋病相關貧血 幹擾素-β 癌癥、血友病 A 人生長激素 兒童生長缺陷 粒細胞集落刺激因子（G-CSF） 中性粒細胞減少癥 葡萄糖腦苷脂酶 I 型 戈謝病 單克隆抗體 Panorex 結腸癌 單克隆抗體 RituxanTM（利妥昔單抗） 非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤 單克隆抗體 Simulect (basiliximab) 移植排斥單克隆抗體 Zenapax (Dalizumab) 移植排斥組織 工程皮膚 Apligraf 深部潰瘍、抗體診斷試驗 用於各種疾病的體內成像試劑，如：潰瘍、潰瘍性結腸炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍性結腸炎、潰瘍性結腸炎等。g.,各種疾病的體外成像試劑，如結腸癌、前列腺癌、乳腺癌定位；各種疾病的體外檢測，如早孕、乙型肝炎、艾滋病等。------------------------------------------------- --------------- 表 3 利用動物細胞培養技術正在開發的部分生物制劑 ---------------------------------------------------------------- 產品 適應癥 --------------------- ------------------------------------------- 凝血因子 VII、因子 IX 血友病 凝血酶原 血小板增殖 各種白細胞介素 癌癥、血細胞疾病、炎癥等的疫苗艾滋病疫苗、多價或單價疫苗等單克隆抗體，包括治療和診斷癌癥、敗血癥、類風濕性關節炎、自身免疫基因工程單克隆抗體 用於治療癌癥、敗血癥、類風濕性關節炎、性傳播疾病、結腸炎、器官移植、免疫排斥抑制劑等的基因治療載體用於治療癌癥、囊性纖維化等的基因治療載體組織工程產品 用於生物人組織和器官的不依賴於組織的生長因子和激素 癌癥、傷口治療、傳染病、骨髓移植、生長障礙、多囊卵巢疾病 卵泡刺激素 不育癥 溶栓劑（u-PA） CD4 免疫黏附劑 艾滋病可溶性受體 癌癥、傳染病、炎癥、敗血癥 幹細胞或體細胞擴增、幹細胞療法，如免疫細胞療法，如治療癌癥、乙型肝炎、艾滋病等。-------------------------- -------------------------------------- 為什麽選擇動物細胞作為生物制品的宿主系統 DNA 重組技術可選擇多種宿主系統來表達目標蛋白質。常見的宿主系統包括：細菌、酵母、黴菌、絲狀真菌、植物細胞、哺乳動物細胞以及動物和植物。每種表達系統都有各自的優缺點，在選擇時應主要考慮產品的特性。細菌等原核表達系統繁殖快，易於培養，但表達的蛋白質缺乏轉錄後修飾，如蛋白質限制酶位點、二硫鍵、特殊糖基化、磷酸化、酰胺化等，缺乏形成天然蛋白質精確三維結構的環境。許多蛋白質的生物活性與轉錄後修飾有關，原核系統表達的蛋白質壹般是細胞內產物，需要破壁提取，給產物的分餾和純化帶來困難，也容易受到外源毒素的汙染。真核表達系統表達的蛋白質經過轉錄後修飾，在結構和功能上與人體分泌的天然蛋白質非常相似（因此，21 世紀的美國 FDA 更傾向於使用真核表達系統生產蛋白質藥物），幾乎所有原核細胞表達的蛋白質都可以用真核表達系統生產，反之則不行。而且，動物細胞表達系統表達的蛋白質是細胞外分泌的，產物的分離純化非常簡單，但由於大規模細胞培養技術的復雜性，目前仍處於發展和完善階段，許多重組蛋白仍選擇用原核表達系統生產。原核表達系統壹般用於生產小分子、結構簡單的蛋白質，蛋白質的轉錄無需修飾，如胰島素。另壹方面，真核表達系統主要用於生產大分子和復雜蛋白質，轉錄後修飾對蛋白質的生物活性有重要影響，如組織型纖溶酶原激活劑（tPA）、促紅細胞生成素等（EPO）。某些蛋白質可以通過原核和真核表達系統生產，如 a-幹擾素、人類生長激素等，這些蛋白質在沒有轉錄後修飾的情況下也具有生物活性。在這種情況下，應綜合考察生產的經濟成本和技術難度來選擇表達系統。表 4 列出了各種表達系統的優缺點。 表 4 生產大量組蛋白的各種表達系統的壹般特征 ------------------------------------------------------------------------- 酵母菌和絲狀真菌 細菌 大腸桿菌 動物細胞 -------------------- 糖基化組 否 否 是 如果糖基化和結構與哺乳動物細胞表達的蛋白質不同 培養時間 天 幾十個小時 幾十個小時 周-月 ---------------------------------------------------------------------------- 今天 動物細胞技術在生物制藥領域發揮了巨大作用，1990 年動物細胞大量培養物制成的產品銷售占所有生物技術產品的 50%以上。更重要的是，許多細胞工程產品以前無法獲得足夠的治療用量，或者生產成本極其昂貴！
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