制備感受態細胞時有哪些註意事項？

方法壹:細菌轉化的方法多基於孟德爾和Higa(1970)的發現。基本方法是用冰預冷的CaCl2 _ 2或多種二價陽離子處理細菌，使其進入感受態而被轉化。用CaCl2 _ 2制備大腸桿菌的新鮮或冷凍感受態細胞常被用於批量制備感受態細菌。該方法適用於大多數大腸桿菌菌株，且快速、重現性好。操作過程簡述如下。1.從37℃培養的新鮮平板上挑取單菌落(如大腸桿菌DH52)或16 ~ 20 h的1ml新鮮過夜培養物，轉移到含100mlLB培養基的1L或500ml中。在37℃下劇烈振蕩培養約2 ~ 3小時(200 ~ 300 r/min轉臺式)，每隔20 ~ 30 min測壹次OD600值≈0.4。2.無菌條件下，將細菌轉移至用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，置於冰上10 ~ 20min。3.用SorvallGS2轉子(或與其離心管匹配的轉子)在4℃下以4000轉/分鐘離心10分鐘以回收細胞。4.倒數培養液，倒置試管65438±0分鐘，使最後殘留的微量培養液耗盡。5.用10ml用冰預冷的0.1mMCaCl2懸浮每個沈澱物，並將其置於冰上。6.用SorvallGS3轉子(或其相應的轉子)在4℃以4000轉/分鐘離心10分鐘以回收細胞。7.倒出培養液，將試管倒置65438±0分鐘，使最後殘留的微量培養液流盡。8.每50毫升初始培養物重懸2ml用冰預冷的0.1MCaCl2，然後迅速將細胞分成小份，液氮冷凍，保存於-70℃備用。9.用冷卻的無菌吸頭從每個感受態細胞懸液中取出200μl，轉移到無菌微量離心管中，向每個管中加入DNA或連接反應混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉使內容物混合均勻，並置於冰中30分鐘。10.將離心管放在試管架上，放入預熱到40℃的循環水浴中90秒~ 2分鐘，不要搖動試管。11.迅速將試管轉移到冰浴中，讓細胞冷卻1 ~ 2分鐘。12.在每個離心管中加入800μlSOC培養基，水浴加熱培養基至37℃，然後將試管轉移至37℃的搖床中，孵育45分鐘以復活細菌，並表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。13.將適當體積(每90mm平板最多200μl)的轉化感受態細胞轉移至含有200mmol/lMgSO4和相應抗生素的SOB培養基中。14.將盤子放在室溫下，直到液體被吸收。15.倒置平板，37℃培養，12 ~ 16h後可出現菌落。方法二:Cassuperone-stepcompontcellprepkit用壹種簡便的方法處理大腸桿菌，使之成為感受態細胞，便於質粒DNA轉化，能滿足壹般實驗的要求。與CaCl2 _ 2法相比，它有許多優點:使用方便，只需壹步即可完成感受態細胞的制備；轉化效率略高於CaCl2 _ 2法，壹般可達106-108cfu/μg，滿足壹般實驗的需要。感受態細胞制成後可在-70℃保存，不加甘油，長期保存後其活力無明顯下降。編制:1。將從液氮或低溫冰箱中取出的冷凍大腸桿菌菌種在LB平板上交叉，37夜後長出單菌落。挑取兩個形態完整的單菌落，分別接種於5mlLB培養基中，37℃、250rpm培養過夜。2.第二天，從5mlLB培養物中吸取200μl，轉移到50mlLB培養基(250ml錐形瓶)中，37℃，250rpm培養2小時，此時OD600約為0.4-0.5。感受態細胞的制備:3。吸取1ml菌液於1.5ml離心管中，以5000rpm離心5分鐘，棄去上清液。4.加入100μl預冷溶液a，懸浮細菌，冰浴30分鐘。5.此時，感受態細胞已準備好立即使用或保存在-70℃下。細胞轉化:6。將100pg-10ngDNA加入感受態細胞中，混勻，冰浴30分鐘，然後42℃熱休克1分鐘，再冰浴2分鐘。加入0.9mlLB培養基，20μ溶液，37℃，振蕩培養65438±0小時。7.取適量菌液(100-200μl)塗於相應電阻的平板上。8.過夜培養約16小時，計數菌落，計算轉化率。補充說明:1。使用的儀器必須幹凈；2.操作步驟2中培養基的裝載量也很重要，建議裝載量不要高於這個值:500ml錐形瓶100ml培養基，250ml錐形瓶50ml培養基；3.可在收菌前半小時在培養基中加入20mM MgCl2，效果會更好；4.為保證細胞處於對數生長期，培養細胞的od值不應高於0.6；5.制備感受態細胞時，所有操作應盡可能在冰上進行；6.細胞轉化操作第六步，冰浴後可直接加入新鮮LB，無需熱激，簡化了操作步驟，但轉化效率低於熱激法，適用於對轉化率要求不高的實驗。方法三:1。將1%大腸桿菌接種於含2mlLB培養基的試管中，37℃搖床培養過夜。2.將0.1ml過夜培養物轉移至含有10mlLB培養基的三角瓶中，37℃振蕩培養3小時，直至OD600=0.3ml離心管。4.在4℃下以4,000 rpm離心5min，除去上清液5。將細菌懸浮於15m1的冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置於冰上30min6，然後在4℃下以4,000 rpm離心10min，除去上清液7。將細菌懸浮在0.65438。方法四:(1)在100ml2×YT燒瓶中接種1ml過夜培養的細菌(如DH52、TG1、TM101)。在37℃劇烈震蕩時，≥200rpm培養的細菌密度約為OD 550 = 0.2 ~ 0.5 (5× 107個細胞/ml)，耗時2 ~ 4小時。(2)冰上冷藏培養物65438±00分鐘，4℃離心細菌培養物，65438±00000轉/分鐘離心65438±00分鐘。(3)棄去上清液，將細菌懸浮於50mMCaCl2和10 mm Tris HCl (pH 8.0)中，體積為原培養體積的壹半。(4)將細菌在冰上懸浮約5min，然後將懸浮液在4℃離心10000/rpm 10min。(5)棄去上清液，將細菌懸浮於原培養體積1/15 50m CaCl和10 mm Tris HCl (pH 8.0)中進行無菌冷凍。此時，細胞為感受態細胞，可用於轉化。200μl分裝於無菌1.5ml微量離心管中，保存於-80℃冰箱中。方法五:TSB法(也是我最喜歡的方法)1。藥物制劑1MMg2+(1MMgSO4和1MMgCl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。TSB溶液(30mL/ 80mL菌液)(現已有):PEG 33503 GTryptone 0.3 gyeast extract 0.15g NaCl 0.3g 2。步驟:(1)活化菌株(2)挑取單菌落並在5mL液體培養基中培養(3)取50uL液體培養物並在80mL液體培養基中擴增(4 OD600在0.4-0.6離心(5)，上清液(6)加入20ml TSB，重懸(7)離心，上清液(8)加入10ml TSB，然後加入甘油15-20所有使用的藥物都必須消毒。在轉化程序(1)中，取出200μl感受態細胞並緩慢溶解，立即置於冰上，加入DNA或連接反應混合物，DNA的量通常≤50mg。用手指敲打試管10次使其混合均勻，然後放在冰上40 ~ 45 min。(2)將試管放入42℃水浴中2分鐘。(3)然後直接在每個試管中加入1.0ml2×YT培養基，倒置混勻，37℃培養8 ~ 12h，幹浴或水浴，不振蕩。在此期間，細菌生長並開始分泌抗生素。(4)在6個2×YT瓊脂培養板中，每200μl轉化液添加相應的抗生素，轉化液中含有X-gal(20mg/ml)和IPTG(200mg/ml)。