1.1.1方法
(1)檢測方法為商用試劑盒和自建實驗室方法，商用試劑應嚴格按照說明書操作。下面介紹的方法是自建實驗室方法，供參考。
(2)逆轉錄PCR(RT-PCR)用於檢測血漿或血清樣本，推薦第壹輪PCR擴增采用RT-PCR壹步法；血細胞或組織樣本的檢測使用PCR方法。通常，使用具有兩輪擴增的巢式PCR。
(3)設置陽性、陰性和空白對照。陽性對照是與待測樣品同源的含有目的基因的樣品；陰性對照是與待測樣品同質且不含靶基因的樣品。陽性和陰性對照樣品應與待測樣品的處理程序壹致。陰性對照的數量應根據實驗樣本的數量設置在不同的位置。
1.1.2試劑
(1)PCR引物:通常使用用於擴增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR的引物。下遊特異性引物或隨機引物可用於RNA逆轉錄。引物設計可參考文獻或自行設計，並應盡可能覆蓋常見的HIV流行毒株，或使用合並引物。
(2)主要試劑:包括核酸提取純化、逆轉錄和PCR所需的試劑。使用商業核酸提取和純化試劑、逆轉錄酶反應試劑和PCR擴增試劑。
(3)抗汙染試劑:實驗室自建檢測方法可使用抗汙染試劑，參照尿嘧啶DNA糖基化酶抗汙染方法。
1.2擴增目的基因片段
1.2.1樣品收集和處理
1.2.2核酸提取
可以使用商業化的試劑或設備，如矽膠柱離心法、磁性矽膠顆粒分離法和自動儀器，並按照說明書進行操作。提取RNA時要註意防止RNA降解。DNA應保存在-20℃，RNA和長期DNA應保存在-80℃。
1.2.3逆轉錄合成cDNA。
使用商業試劑並遵循說明。逆轉錄cDNA合成反應需要使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液、適量無RNA/DNase的超純水和RNA模板。逆轉錄反應在特定的溫度和時間下，在擴增儀或水浴箱中進行。建議使用商用RT-PCR壹步法試劑進行首輪擴增反應。
1.2.4 PCR擴增反應
使用商業試劑並遵循說明。PCR反應需要引物、dNTPs、DNA聚合酶(如Taq酶等。)、緩沖液、適量不含RNA/DNA酶的超純水、模板(DNA或cDNA)。在放大器中，根據設定的程序進行放大。壹般采用二次擴增的巢式PCR擴增法。
1.3擴增產物分析及結果報告。
1.3.1的擴增產物分析
擴增產物常用的分析方法是瓊脂糖凝膠電泳，與分子量標準比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量範圍內。其他擴增產物分析方法包括限制性酶消化分析、特異性探針雜交分析和DNA序列分析。自動核酸擴增儀采用酶聯比色分析或熒光探針雜交來測定。
1.3.2結果的判斷和報告
(1)實驗成立條件:每次試驗應同時做兩個陽性對照和兩個陰性對照。只有當陽性對照擴增出預期片段，陰性對照沒有擴增出片段，兩個平行樣本的結果壹致時，實驗才能成立，才能做出核酸陽性或陰性反應結果的判斷。
(2)HIV核酸檢測陽性:如果使用市售檢測試劑，發現核酸陽性反應，應反復采集樣本進行復檢；如果復檢結果為核酸陽性，則判定為核酸陽性；如果復檢結果為核酸陰性，則判定為不確定結果，需要進壹步跟蹤檢測。
(3)HIV核酸檢測陰性:只有這個實驗結果才能報陰性。
(4)測試報告應在測試完成後7個工作日內出具。2.1方法
HIV核酸的定量檢測主要基於兩種方法:靶核酸擴增RT-PCR和信號擴增。國內常用的方法中，Nuclelisens Say Q HIV-1v 1.1采用國際單位(IU/ml)，與NASBA拷貝數的關系基本為1:1；Amplicor Cobas的拷貝數約為1.2 ~ 1.5國際單位；bDNA方法的拷貝數約為0.8 ~ 1.0國際單位。不同方法之間的關系與HIV的亞型有關。
2.2試劑
必須嚴格按照說明書使用和操作經中國藥品生物制品檢定所註冊和批準的商用試劑。
2.2.1靶核酸擴增試劑及性能
(1)RT-PCR擴增試劑
1) Amplicor HIV-1監測V1.5 (RT-PCR微孔板捕獲比色法)，核酸手工提取(異丙醇沈澱)，比色法分析測定。擴增靶核酸為gag基因區，可擴增HIV-1M群的A-H基因亞型。標準方法的檢測線性範圍為400 ~ 750000；超敏反應法的線性範圍為50 ~ 100000 RNA拷貝/ml。
2)Cobas ampli cor HIV-1 monitor v 1.5，手工提取核酸(異丙醇沈澱)和儀器測定。擴增靶核酸為gag基因區，可擴增HIV-1M群的A-H基因亞型。標準方法的檢測線性範圍為400 ~ 750000；超敏反應法的線性範圍為50 ~ 100000 RNA拷貝/ml。
3)Cobas ampli pprep/Cobas ampli cor HIV-1 Monitor v 1.5(Cobas ampli cor分析儀)，核酸由儀器提取，儀器測定。擴增靶核酸為gag基因區，可擴增HIV-1M群的A-H基因亞型。標準方法的檢測線性範圍為400 ~ 1，000，000；超敏反應法的線性範圍為50 ~ 100000 RNA拷貝/ml。
上述三種試劑均采用基於PCR的擴增靶核酸檢測方法，區別僅在於使用的設備、自動化程度和樣品制備方法。
4)Cobas ampli prep/Cobas TaqMan HIV-1檢測(實時熒光探針RT-PCR分析)，用儀器提取核酸，用實時熒光探針PCR擴增儀測定核酸。擴增靶核酸為gag基因區，可擴增HIV-1M群的A-H基因亞型。檢測的線性範圍為40 ~ 10，000，000個RNA拷貝/ml，比上述三種方法的線性範圍更寬，樣品無需稀釋即可壹次性檢測。
以上四種試劑均使用壹種內部定量標準，1陰性，1弱陽性，1強陽性外部質控。使用DUTP/UNG抗汙染試劑。
HIV RNA的LCX定量分析(競爭性RT-PCR微粒酶免疫分析)，手工或儀器提取核酸(經活化矽膠柱純化)，儀器測定。擴增靶核酸位於pol(整合酶)基因區，可擴增HIV-1基因群M和0群病毒的A-G亞型，尤其可檢測M基因群C亞型和部分重組病毒。檢測的線性範圍為50 ~ 1，000，000 RNA拷貝/ml；使用壹個內部定量標準和六個外部定量標準。
6)實時HIV-1分析(實時熒光探針RT-PCR分析)，使用獨特的雙鏈熒光探針。用手或儀器提取核酸(磁性顆粒純化)並用儀器測定。擴增的靶核酸為pol(整合酶)基因區，HIV-1基因的亞型為M群A-G亞型，M群0亞型，N群病毒。檢測的線性範圍為40～1，000，000 RNA拷貝/ml。使用內部定量標準。檢測結果與LCX HIV RNA的定量檢測結果高度相關。
(2)基於核酸序列的擴增試劑(NASBA擴增技術):以等溫方式直接擴增HIV-1 RNA。
nuclelisens Sayq HIV-1v 1.1(實時熒光探針分析)，用熒光標記分子信標探針技術檢測擴增子。手工或儀器提取核酸(矽膠純化，異丙醇沈澱)，儀器測定。靶核酸為gag基因區，HIV-1基因亞型為M群A-G亞型。檢測的線性範圍為50 ~ 300萬RNA國際單位/ml；用的是壹個內在的量化標準，沒有外在的陰陽對照。壹次檢測8個樣本的整數倍，最多48個樣本。檢測結果與Versant HIV-1 RNA和ampli cor HIV-1 Monitor v 1.5方法的結果高度相關。2.0套件已在國際上得到推薦。
2.2.2信號擴增試劑及性能
Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA(分支DNA探針雜交微孔板捕獲比色分析)，利用分支DNA的多級信號放大原理。不需要RNA純化和PCR擴增步驟。離心濃縮病毒，用去汙劑和蛋白酶K消化釋放病毒RNA，用儀器測定。擴增的靶核酸位於pol基因區，HIV-1基因的亞型為M組A-H亞型，檢測線性範圍為50 ~ 500,000 RNA拷貝/ml。使用六種外部定量標準，1陰性、1弱陽性和1強陽性外部質量控制。它壹次可以檢測12的整數倍樣本。
EDTA和ACD可用作上述試劑的抗凝劑，肝素也可用作Nuclelisens HIV-1qt和Nuclelisens Sayq HIV-1v 1.1和Versant HIV-1RNa3.0.BDNA的試劑的抗凝劑..如果用肝素處理的血漿樣品必須用於RT-PCR擴增，則必須直接向樣品中加入乙酰肝素酶來消化肝素。
2.2.3實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應管中熒光信號達到設定閾值時的循環數Ct值與模板初始拷貝數的對數之間存在線性關系。標準曲線可以用已知初始拷貝數的標準作成，其中橫坐標代表初始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值)。因此，只要獲得未知樣本的Ct值，就可以從標準曲線計算出樣本的初始拷貝數。
實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為:(1)樣品制備、目標RNA分子的提取和濃縮、去除可能的抑制因子。(2)實時PCR，其中熒光標記的寡核苷酸探針用於檢測PCR產物。檢測的原理是基於熒光信號生長曲線和循環數之間的相關性。(3)RT-PCR反應，即病毒RNA通過逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA，然後通過DNA聚合酶擴增出特定的片段。(4)擴增產物的檢測，基於檢測閾值的設定，當病毒載量高時，可以在低循環數檢測到熒光信號，當病毒載量低時，可以在高循環數檢測到熒光。循環次數與樣品負載呈線性關系。循環次數和負荷的標準曲線可用於定量檢測樣品負荷。利用集體核酸擴增檢測的技術和方法，利用核酸檢測方法的高靈敏度，對高度疑似感染且抗體陰性的樣本進行集體核酸檢測，從而及時發現窗口感染者。這種方法比單壹樣品核酸檢測更具成本效益。
3.1樣本收集程序
3.1.1根據預處理後的樣品量計算出預成型的主次組數，並在登記表上記錄主次組及對應的原始樣品號。
3.1.2吸取130mL樣品，轉移至標有二次收集的離心管中；10樣本形成1300mL二次采集樣本，充分渦旋混合均勻。
3.1.3分別從五個二級采集管吸取2100ml樣品，轉移到標有壹級采集的離心管中，形成由50個樣品組成的壹級采集樣品，體積為1050mL，充分渦旋混勻。
3.1.4從每個壹級和二級采集管吸取500mL采集樣品，分裝到另壹個相應的標記離心管中，用超靈敏核酸檢測試劑檢測。
3.1.5陰性采集外質控品的制備:按上述步驟將50份HIV抗體和核酸陰性標本采集成5份陰性二次采集外質控品和1份壹次采集外質控品。
3.1.6陽性采集外質控品的制備:分別從9份HIV抗體和核酸陰性樣品和1份含有至少10c/ml HIV RNA的陽性樣品中，向離心管中加入130mL，形成1300mL的陽性二次采集外質控品。然後將210mL從四個制備好的陰性二次收集的外質控品和陽性二次收集的外質控品轉移到標有初級陽性收集的外質控品的離心管中，形成初級陽性收集的外質控品。
3.1.7壹級和二級陰性和陽性標本的外質控品分別用於每輪RT-PCR中壹級和二級標本的檢測。
3.2組裝樣品的檢測和分解途徑
商用核酸檢測試劑應嚴格按照試劑說明書使用。根據每個商業核酸試劑組的PCR方案進行檢測，並且根據每個試劑方案操作收集樣品的數量。該方法簡述如下:
3.2.1 HIV RNA RT-PCR超敏反應檢測法檢測壹級采集樣本，陽性壹級采集樣本進入下壹檢測步驟。
3.2.2 HIV RNA RT-PCR超敏反應檢測法用於檢測構成陽性壹級采集的所有二級采集樣本，陽性二級采集樣本進入下壹檢測步驟。
3.2.3采用HIV RNA RT-PCR標準檢測方法，對構成陽性二次采集樣本的全部10份個體樣本進行檢測，確定核酸陽性的單壹樣本。感染艾滋病病毒的婦女所生的嬰兒在出生後18個月內可被診斷為攜帶艾滋病病毒核酸(DNA或RNA)。雖然在感染早期(出生後1個月內)HIV RNA檢測的靈敏度較高，但HIV DNA檢測不受母親圍產期抗逆轉錄病毒治療、母乳中抗逆轉錄病毒藥物和嬰兒預防性抗逆轉錄病毒治療的幹擾。另外，考慮到母親的血液汙染，不建議使用臍帶血進行HIV核酸檢測。嬰兒抗體檢測的流程和結果判定見第二章(HIV抗體檢測)。
4.1適用範圍
18個月以下感染艾滋病毒的婦女所生的嬰兒；對於18個月以下嬰兒，其母親HIV感染狀況不明，且患兒有HIV相關臨床表現，臨床懷疑感染HIV。
4.2測試程序和結果報告
4.2.1在嬰兒出生後第6周(42天)采集第壹份血樣(血樣可配制成DBS或EDTA抗凝全血)，送檢。
4.2.2如果第壹份血樣呈陽性，應盡快采集第二份血樣進行檢測。如果兩個血樣都呈陽性，報告“嬰兒HIV感染早期診斷陽性結果”以診斷兒童HIV感染。及時跟蹤監測艾滋病病毒感染兒童，將其轉診至兒童抗病毒治療醫療服務機構，為其提供機會性感染預防等服務措施；如果第二次血樣呈陰性，則在寶寶滿3個月後再次采集血樣進行檢測。如果第壹次血樣檢測為陰性，繼續提供兒童保健和隨訪服務，在寶寶3個月後再次采集血樣進行檢測。
4.2.3嬰兒3個月後再次檢測為陰性的，報告“嬰兒感染艾滋病病毒早期診斷和檢測結果為陰性”，繼續按照未感染兒童的待遇提供兒童保健隨訪服務；12個月時，按照《HIV感染婦女所生子女HIV抗體檢測流程》(圖4)，開始HIV抗體檢測，最終確定孩子的感染狀況。如果寶寶3個月後再次呈陽性，盡快再次采集血樣進行檢測。第三份血樣呈陽性，報告“嬰兒感染艾滋病病毒早期診斷和檢測結果呈陽性”；若第三份血樣為陰性，報告“嬰兒感染艾滋病病毒早期診斷和檢測結果為陰性”；分別按照上述流程提供相應的服務。
4.2.4不同時間“嬰兒感染艾滋病病毒早期診斷”結果為陰性的母乳餵養兒，應在完全停止母乳餵養後第6周和第3個月(如果第6周檢測結果為陽性，應盡快)再次抽取血樣進行核酸定性檢測，以進行早期診斷。孩子18個月後可以直接檢測抗體。
4.2.5如果寶寶第壹次采血時是3個月但不到12個月，應盡快在不同時間采集兩次血樣；同時會送兩個血樣送檢，按照上述流程進行檢測。如果兒童第壹次采血時已滿12個月，應首先按照《艾滋病感染母親所生兒童艾滋病病毒抗體檢測流程》(圖4)進行艾滋病病毒抗體檢測。如果兩個不同原理或廠家生產的HIV抗體檢測試劑檢測結果為陰性，則排除兒童感染；如果HIV抗體檢測試劑檢測結果為陽性，且不能通過抗體檢測確定患兒的感染狀況，可在不同時間采集兩份血樣，按上述流程進行“嬰幼兒HIV感染早期診斷”檢測。如果兒童第壹次采血時已滿18個月，則應按照HIV抗體檢測流程(圖1)進行HIV抗體檢測，無需進行“嬰兒HIV感染早期診斷”的檢測。