因此，在嚴格的蛋白質印跡實驗設計中需要壹個好的參照系統，這對實驗結果的分析非常有用。尤其是實驗出現問題的時候，借助參照系很容易發現問題，不用撓頭抱怨。壹個好的參照系統通常包括分子量標記(用於確定蛋白質條帶對應的分子量)、空白載體對照(如果是誘導表達系統，誘導前應有對照)、已知量標準品的陽性對照；還有內部參考。但由於資金的限制或懶惰，國內很多人在做Western Blot時往往會遺漏參考文獻，導致結果有問題時無法分析結果——即使有結果，也可能影響結果的分析。內參是最容易被忽略的壹項。
我們知道，Western Blot可以用來比較不同條件下或不同組織中目的蛋白的相對表達量，前提是加載相同量的細胞，這樣才能得到比較的依據。特別是在表達水平不高的情況下，樣本量的差異很可能會影響結果的分析。所以妳需要內參。內參即內部對照，壹般指哺乳動物細胞中由看家基因編碼表達的看家蛋白。它們在各種組織和細胞中的表達是相對恒定的，當檢測蛋白質表達水平的變化時，它經常被用作參考。在Western Blotting實驗中，除了蛋白提取、蛋白定量、蛋白上樣電泳、膜轉移、目的蛋白抗體孵育、顯色等步驟外，還需要檢測內參，以修正蛋白定量和上樣過程中的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。
在國外發表的文章中，Western Blotting實驗的結果必須用內參校正已成為慣例。然而，國內仍有許多研究者忽視了蛋白質印跡實驗中內參的使用，將蛋白質濃度的測定作為需要相互比較的各種樣本間樣本量等效性標準化的唯壹途徑。但是，各種蛋白質濃度的定量方法都有局限性，不能完全準確地確定各種樣品的準確蛋白質濃度。例如，UV方法適用於檢測純的和相對單壹的蛋白質。與比色法相比，操作簡單，但易受平行物質幹擾，如DNA。靈敏度低，所需蛋白濃度高。用比色法測定蛋白質濃度有幾種方法，如BCA法、布拉德福德法和勞裏法。BCA法和勞裏法都容易受到蛋白質和洗滌劑的幹擾。布拉德福德法具有最高的靈敏度，並與壹系列幹擾勞裏和BCA反應的還原劑(如DTT和巰基乙醇)相容。但是對洗滌劑還是比較敏感的，主要缺點是標準不同會導致同壹個樣本的結果差異很大，沒有可比性。
另外，蛋白質定量後，進行電泳時需要上相同量的樣品，這壹步也存在操作誤差。在Western blotting實驗中使用內參可以很容易地糾正定量和上樣步驟帶來的誤差。在Western Blotting中使用內參，實際上是在WB過程中用內參對應的抗體檢測內參，使內參的表達與目的產物同時被檢測到。由於內參在各種組織和細胞中的表達是相對恒定的，因此可以通過檢測每個樣本中內參的量來修正加載誤差，使半定量結果更加可信。另外，內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉移是否完全，整個Western Blot顯色或發光系統是否正常。
實驗結果的分析其實很簡單:如果樣品中蛋白質的量是有限的，那麽在進行電泳轉印膜實驗時，只需要檢測內部參數和樣品中目標蛋白質的量就夠了。用每個樣品中目標蛋白的量除以其內參含量，得到的值就是內參校正後每個樣品中目標蛋白的相對含量，然後用這個值對樣品進行對比分析，得到不同樣品間目標蛋白含量的實際變化結果。如果樣本量足夠，可以先檢測內參，觀察樣品間內參的色帶是否壹致，根據差異調整每個樣品的樣本量，再次進行Western Blotting實驗，直到內參壹致；如果內參壹致，就可以分析不同樣品之間目標蛋白的表達變化。雖然這樣有點麻煩，但是可以保證結果更有說服力和可信度。畢竟我們的實驗是壹項嚴謹的工作。
附:在蛋白質印跡實驗中使用內部參照的方法如下:
1.標記內參的使用超級簡單:在二抗孵育過程中加入HRP標記的內參抗體，按照正常操作即可。
2.普通內參:當目標蛋白的分子量與所選內參蛋白的分子量相差不大時，可先進行目標蛋白的抗體溫顯影和檢測。然後用條形緩沖液洗去膜上的抗體，再次進行內參蛋白的抗溫孵育和顯色檢測。
3.當目標蛋白的分子量與所選參照蛋白的分子量明顯不同時，可在轉膜後進行預染色，根據蛋白標誌物的大小將膜切割成大分子量和小分子量兩部分，將參照蛋白與目標蛋白分離。然後將兩種膜分別與內參蛋白抗體和靶蛋白抗體孵育，孵育並顯影第二種抗體。