原理
高效液相色譜法儀根據各種各樣的相互作用力來分離混合物。這種相互作用力通常是分析物及分析管柱之間的壹種非***價性質。
使用高效液相色譜時，液體待檢測物在不同的時間被註入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物中不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，每個峰頂都代表壹個另外化合物的種類，最後通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。
以液體為流動相而設計的色譜分析儀器稱為液相色譜儀。采用高壓輸液泵，高效固定相和高壓靈敏檢測器等裝置的液相色譜儀成為高效液相色譜儀。高效液相色譜儀種類繁多，但不論何種類型的高效液相色譜儀，基本上都分為4個部分：高壓輸液裝置，進樣系統，分離系統和檢測系統。
操作
將要分離和分析的樣品混合物以不連續的小體積（通常為微升）引入滲透通過色譜柱的流動相流中。樣品的組分以不同的速度通過色譜柱，這是與吸附劑（也稱為固定相）的特定物理相互作用的函數。每個組分的速度取決於其化學性質，固定相（柱）的性質以及流動相的組成。
特定分析物洗脫（從色譜柱中出現）的時間稱為其保留時間。在特定條件下測得的保留時間是給定分析物的識別特征。
可以使用許多不同類型的色譜柱，其中填充了粒徑，孔隙率和表面化學性質各異的吸附劑。使用較小的顆粒尺寸的包裝材料需要使用較高的操作壓力（“背壓”）的和通常改善的色譜分辨率（連續的分析物從柱中出現的峰之間的分離度）。吸收劑顆粒本質上可以是疏水的或極性的。
常用的流動相包括水與各種有機溶劑的任何混溶性組合（最常見的是乙腈和甲醇）。壹些HPLC技術使用無水流動相（請參見下面的正相色譜法）。
流動相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或三氟乙酸）或鹽以幫助分離樣品成分。在色譜分析過程中，流動相的組成可以保持恒定（“等度洗脫模式”）或變化（“梯度洗脫模式”）。等度洗脫通常在分離與固定相親和力非常不同的樣品成分時非常有效。
在梯度洗脫中，流動相的組成通常從低到高洗脫強度變化。流動相的洗脫強度由分析物的保留時間反映，高洗脫強度可產生快速洗脫（=較短的保留時間）。
反相色譜中的典型梯度曲線可能始於5％的乙腈（在水或水性緩沖液中），然後在5–25分鐘內線性增長至95％的乙腈。恒定流動相組成的周期可以是任何梯度曲線的壹部分。例如，流動相的組成可以在5％的乙腈中保持1-3分鐘，然後線性變化直至95％的乙腈。
流動相的選定組成取決於各種樣品組分（“分析物”）和固定相之間的相互作用強度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根據它們對固定相和流動相的親和力，在色譜柱中進行分離過程中，分析物會在兩者之間分配。
此分配過程類似於液-液萃取過程中發生的分配過程，但該過程是連續的，而不是逐步進行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脫，壹旦流動相在乙腈中的濃度更高（即，在洗脫強度更高的流動相中），則更多的疏水性組分將較晚洗脫（從色譜柱中洗脫）。
流動相組分，添加劑（例如鹽或酸）和梯度條件的選擇取決於色譜柱和樣品組分的性質。通常對樣品進行壹系列的試驗，以便找到可以充分分離的HPLC方法。
用途
高效液相色譜作為壹種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中，常用於醫藥品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。
高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成分分離、成分定性及定量分析。適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。