乙型肝炎病毒(HBV)是壹種DNA病毒。就像毒蛇分泌的某種毒液只對特定的身體部位起作用壹樣，HBV只對肝臟情有獨鐘，它是生物學中hepadnavividae家族的壹員。在哺乳動物和鳥類中也發現了該家族的病毒。它們的結構、基因序列和復制策略非常相似，但彼此並不交叉。除了針對特定的器官，它們對宿主也有“種族要求”。例如，HBV只對人類和猩猩敏感。
壹個完整的乙肝病毒顆粒，也叫戴恩顆粒，直徑只有42納米，大約是壹個普通雞蛋的百萬分之壹。乙肝病毒有壹個外殼和壹個核心，也就是說，除了大多數病毒都有的漂亮的“外殼”，乙肝病毒還需要壹個精密的“外衣”。外殼就是這個所謂的“外衣”，7-8納米厚，由脂質雙層和蛋白質組成。脂質雙分子層含有S抗原、pre-S1和pre-S2抗原，它們共同構成了殼內的三種蛋白質形式，即乙肝表面抗原(HbsAg)，也就是俗稱的澳洲抗體。還有壹個關於澳洲抗藥性起源的故事，最早是從澳洲土著的血清中分離出來的。當時被認為是當地人特有的遺傳標記，所以被稱為“澳洲抗原”。後來才知道是乙肝病毒表面抗原。所謂抗原，其實就是壹種會引起身體產生抵抗的元素，而相對的，能夠識別和抵抗體內抗原的元素就是抗體。
剝去達諾顆粒的外殼，露出乙肝病毒的核心顆粒。核心顆粒直徑28 nm，呈二十面體，其表面是病毒的真正衣殼，由乙肝病毒核心抗原(HBcAg)組成。遊離的核衣殼只能在肝細胞的細胞核中觀察到。HBV的另壹個主要抗原，e抗原，可以通過強洗滌劑或酶處理而暴露。它的本質不是很清楚，但大多數人認為是核心片段。
Dano顆粒的中心部分是壹個環狀的有缺口的DNA雙鏈和附著其上的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒基因組最顯著的特征之壹是它非常小。它的DNA分子包含約3200個核苷酸，比已知最大的病毒基因組小幾百倍，與人類擁有的基因組相比只有百萬分之壹。而且，HBV DNA的兩條鏈長度不同，長鏈是完整的，長度是恒定的，這是負的。短鏈是長度可變的正鏈，約為長鏈的50% ~ 80%。表面抗原和核心抗原都由Dane顆粒的DNA編碼。
實際上，在電子顯微鏡下可以觀察到三種不同形式的乙肝病毒:大球形顆粒、小球形顆粒和管狀顆粒。大的球形顆粒是Dano顆粒。直徑約22納米的球形小顆粒，是乙肝病毒感染後血液中最常見的。由表面抗原組成，不含乙型肝炎病毒的DNA和DNA聚合酶。管狀顆粒的直徑也約為22納米，長度為50-70納米。實際上是由幾個小的球形顆粒組成，但也具有HBsAg的抗原性。無論是顆粒還是管狀顆粒，都不是完整的乙肝病毒顆粒，而是乙肝病毒感染肝細胞時合成的過量膠囊，遊離在人體血液循環中。
(2)乙肝疫苗的制備
第壹部分:乙型肝炎病毒簡介
乙型肝炎病毒(HBV)導致肝臟炎癥。這種病毒在放大的情況下可以通過圓形、傳染性的“Dane顆粒”和管狀、空的病毒包膜辨認出來。這種疾病的表現包括黃疸和流感樣疾病，而慢性感染可導致嚴重的病理變化，如肝硬化和肝癌。
第二部分:乙型肝炎的治療和預防措施
乙肝病毒也可以將RNA轉錄成DNA，但這種病毒將其基因組的DNA版本包裝成病毒顆粒。與逆轉錄病毒不同，乙型肝炎病毒不會整合到宿主細胞DNA中。
雖然研究人員正在研究有希望的乙肝新療法，但目前唯壹可用的是幹擾素，這種藥物僅對35%至40%的患者有效。
目前尚無有效的抗病毒方法治療慢性乙型肝炎病毒感染，但其血源性疫苗和重組疫苗均可有效預防病毒感染，因此疫苗的研發和生產成為預防和治療該病毒的重要武器。
血源性乙型肝炎疫苗是從乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的血漿中制備的。1976年，Maupas等人首次發現從HBV攜帶者血清中分離出的表面抗原顆粒能刺激人體產生抗HBsAg抗體(HBsAb)，可中和乙肝病毒，有效預防HBV感染。乙肝病毒表面抗原顆粒在攜帶者血清中的含量可以很高，因此可以用來制備疫苗，這就是血源性疫苗，也是第壹代乙肝疫苗。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是HBV的外膜蛋白，由HBV基因組的S區編碼。S區分為三段:前S1、前S2和S基因。它們的讀框同相，串聯排列，可以使用1個終止碼。這三個基因分別編碼preS1、preS2和s蛋白。s區包括許多B細胞和T細胞表位，它們在針對HBV的免疫反應中起重要作用。同時，S蛋白在HBV感染和HBV病毒粒子組裝過程中起著重要作用。HBsAg顆粒形成和分泌的所有信息都在S蛋白中，preSl區N端有1滯留信號，可以拮抗S蛋白的分泌信號。1.2 HBV的免疫原性。
研究證實，接種S蛋白，即Bag蛋白，可以有效預防和治療乙肝..柯亨寧等構建了乙肝病毒S抗原的表達質粒(PS)，證實PS表達HBsAg體外。分別免疫BALB/c小鼠後，發現PS能有效誘導小鼠體液免疫。同時，M蛋白中前S2區編碼的肽也具有較高的免疫原性，可以克服與S蛋白壹起作為疫苗時對HBsAg無免疫應答的現象。有學者認為全長L蛋白具有更高的免疫原性。
乙肝的防治主要是壹個免疫病理過程，機體對preS多肽的免疫反應對阻斷HBV再感染具有重要意義。針對preS多肽的體液免疫和細胞免疫在清除病毒和促進機體恢復方面也起著非常重要的作用。
雖然血源性乙肝疫苗具有良好的保護作用，但它是由乙肝表面抗原(HBsAg)的血漿制備的。理論上其安全性無法滿足100%的要求，存在潛在危險。隨著基因工程的發展，第二代乙肝疫苗即基因工程疫苗取得了巨大成功，合成肽乙肝疫苗和乙肝DNA疫苗的研究也取得了進展。這類多肽或亞單位疫苗在產量、質量、免疫原性和安全性等方面都有很大優勢，正在逐步取代血源疫苗。
基因工程疫苗又稱基因重組疫苗，是將編碼抗原的基因克隆到表達載體中，將重組質粒DNA直接註射到動物體內，使相應的抗原在動物體內表達，機體產生針對該抗原的免疫應答。這就是核酸免疫技術或DNA疫苗。DNA免疫的結果不僅產生了相應的抗體，還產生了特異性的細胞免疫應答，這對於抵抗HBV感染具有重要意義。
通過檢查，證明基因工程疫苗的免疫原性與血源疫苗相同，不存在血源為原料帶來的潛在危險(存在乙肝、丙肝、艾滋病等疾病的血源性傳播危險)。
早期，人們研究利用大腸桿菌原核表達系統生產乙肝基因工程疫苗，但由於表達水平低、產品不穩定而失敗。最早的成功是在酵母方面。Valenzuela等人通過將adw亞型HBsAg基因置於酵母乙醇脫氫酶(ADH)啟動子的控制下，成功地在啤酒酵母中表達了HBsAg。之後科研人員紛紛效仿，研發出可以進入市場的酵母表達的乙肝基因工程疫苗。近年來，酵母表達系統不斷優化。張偉等人通過PCR擴增不同大小的含有HBV前S區的cDNA片段，克隆到pUC19質粒中，再克隆到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中。將重組質粒導入酵母AH109中表達，檢測其表達產物，表明其對酵母AH109和報告基因有激活作用。Vassileva等[5i]利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子實現了HBsAg基因在畢赤酵母中的表達。在GAP啟動子的作用下，抗原卵能夠持續表達，ELISA實驗表明表達產物具有有效的免疫原性。該研究進壹步促進了酵母表達系統的發展。
酵母表達系統的優點是:①系統簡單，生產易於控制，產量穩定；②高表達水平；③表達產物HBsAg可組裝成表面抗原顆粒，顆粒的免疫原性比單體HBsAg強1000倍以上，這是表達產物成為疫苗的關鍵。但該系統也存在壹些缺點，如酵母表達的HBsAg不能分泌，給產物的分離純化帶來更多困難；酵母表達的HBsAg在酵母系統中的過度糖基化不僅使產物的穩定性變差，而且影響免疫原性。
(三)乙肝抗體的產生及其作用機制
抗體產生的過程大致如下:抗原進入細胞後，淋巴濾泡和生發中心的數量增加。這些區域是特異性B淋巴細胞，在對抗原的反應中具有不同的分化階段。在抗原刺激下，這些細胞的胞質中含有豐富的多聚體和粗面內質網增多。部分受刺激的B細胞分化為漿細胞，合成分泌球蛋白，內含豐富的粗面內質網和發育良好的高斯小體。當免疫球蛋白分子在分泌前通過高斯體時，糖殘基與H鏈結合。此時產生的抗體反應並沒有產生大量的抗體。其中，B細胞中仍以IgM為主，B細胞數量的增加明顯在其細胞膜表面有免疫球蛋白分子。當第二次用抗原刺激時，B細胞迅速被激活，對大量已有的抗原產生反應，這就是血清中特異性7S抗體球蛋白迅速升高的原因。
清除HBV的重要免疫機制是感染早期的HBV特異性細胞免疫反應啟動清除HBV的過程，機體的重要免疫效應是細胞因子介導的清除HBV的非肝細胞損傷機制，機體在清除HBV的過程中不壹定有肝細胞損傷。肝細胞可能在壹定條件下產生IFN等細胞因子，通過上述機制直接主動清除HBV。
首先，HBV病毒感染早期的HBV特異性細胞免疫反應是機體啟動消除HBV病毒過程的關鍵因素。在急性HBV感染者體內誘導的針對HBV的特異性免疫應答是多克隆、多特異性的強細胞免疫應答，病毒最終被消滅；然而，在慢性HBV感染的患者中，對HBV的特異性細胞免疫反應較弱，並且身體對HBV具有免疫耐受性。HBV感染早期外周血肝外致敏CTL可產生IFN2γ、TNFα等細胞因子。當它隨血液流經肝竇內皮細胞時，CTL被進壹步激活，釋放出更多的細胞因子。此外，肝細胞表面的HBV抗原可進壹步激活HBV特異性CTL，再次釋放細胞因子。特異性CTL持續激活增殖1，持續釋放大量細胞因子。此外，活化的CTL產生的細胞因子還可以通過肝臟中肝竇內皮細胞之間的孔隙，激活肝臟中的非特異性免疫細胞，如肝內N K細胞和N K2T細胞，產生大量IFN2γ、TNFα等細胞因子抑制HBV復制，這是為了免疫放大。因此，壹旦CTL被HBV抗原刺激激活，就會啟動級聯反應，放大刺激信號，激活更多的抗HBV效應，最終達到消滅HBV的目的。因此，HBV感染早期的特異性細胞免疫刺激了非裂解性消除HBV的機制，這是啟動消除HBV過程的關鍵。
二是細胞因子如IFN2γ、TNFα作用於肝細胞表面受體發揮清除HBV的作用，特異性CTL和非特異性免疫細胞發揮同樣的作用，從而實現乙肝急性早期對不溶性細胞病毒的清除。它們* * *相同的有效途徑是產生有效的細胞因子，如IFN2γ、TNFα，通過細胞因子作用於肝細胞，進而發揮清除HBV的作用。已知幹擾素的抗病毒機制之壹是通過與靶細胞表面相應的受體結合，誘導靶細胞合成抗病毒蛋白(AVP)，如蛋白激酶(PKR)、225A合成酶PRNase L、Mx蛋白等。發現IFN2α能誘導HBV轉染的肝癌細胞產生MxA蛋白，並抑制HBV DNA的復制。Guidotti等人將HBV轉基因小鼠分別與蛋白激酶(PKR)基因和RNase L基因缺陷小鼠雜交，發現IFN2α/β和IFN2γ均可誘導蛋白激酶抑制HBV復制。IFN2γ和TNFα不僅能裂解完整的La蛋白導致HBV RNA不穩定，還能誘導某種核酸酶活性的增加，在此作用下HBV RNA最終被降解，從而阻斷HBV復制。
三、靶細胞破壞清除病毒的機制當HBV感染不是必需的在清除HBV的過程中，CTL被認為不僅通過清除病毒和控制感染來保護肝臟，而且是引起肝臟損傷的主要效應細胞。肝細胞不僅是HBV感染後被動攻擊的靶細胞，也是直接清除HBV的主動免疫效應細胞。在壹定條件下，肝細胞自身可產生IFN等細胞因子，通過上述機制直接清除HBV。由於肝細胞數量巨大，其抗病毒能力應該也很強。只要肝細胞能夠產生足夠的IFN和其他細胞因子，就可以在不裂解細胞的情況下，抑制病毒復制，消除HBV。