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質粒轉染和病毒感染

隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展,轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中,其應用越來越廣泛。

1. 轉染的分類:物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。

物理介導:電穿孔法、顯微註射和基因槍法;

化學介導:經典的磷酸鈣***沈澱法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;

生物介導:較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

2. 三種轉染方法具體介紹:

電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入(實驗條件控制較嚴、難度較大);

脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞(常用,質體與質粒的比例,細胞密度,轉染的時間長短和培養基中血清的含量都影響轉染效率);

病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞(前期準備較復雜、對細胞可能有較大影響);

3.質粒:真核細胞細胞核外或原核生物擬核區外能夠進行自主復制的遺傳單位。

包括真核生物的細胞器(主要指線粒體和葉綠體)中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸(DNA)分子。

在基因工程中質粒常被用做基因的載體(Vector),質粒上常有抗生素的抗性基因,例如氨芐抗性基因或 卡那黴素 抗性基因等。

4.病毒轉染:外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。可用於RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究,穩轉細胞株的篩選,為活體動物模型實驗。

慢病毒載體的包裝系統壹般由兩部分組成,即包裝成分和載體成分。前者能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白;後者同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。

步驟: 1 )構建載體 2 )包裝提純病毒 3 )感染靶細胞

為產生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質粒同時***轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液後,可以直接用於宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之後,經過反轉錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。

5. 質粒轉染和病毒感染異同:

(1)質粒轉染:相對簡單的基因傳遞方式,與病毒載體主動進行細胞攻擊侵染方式不同,質粒轉染屬於被動擴散。

優點:質粒載體構建流程相對簡單,速度快(病毒載體都需要先構建載體後包裝成病毒顆粒)

缺點:a.在細胞水平,質粒轉染效率不穩定,不同細胞依照不同的轉染方法和轉染介質,效率差別較大,且大部分方法效率不高;

b.質粒轉染壹般入核效率低,特別是陽離子脂質體,陽離子聚合物等介質,電轉質粒入核的效率則比介質轉高不少,但比起慢病毒轉染,效率仍然低很多,且對細胞損傷較大。

(2)病毒載體轉染:病毒粒子是病毒殼(介導細胞轉導/引入整合酶/介導體內靶向轉導)+目的基因的復合物,不用或者用簡單的試劑就能完成基因導入。

優點:轉染效率高,應用不同的病毒載體工具可實現細胞和動物的高效轉導和穩定轉導。

缺點:不同的病毒載體的包裝需要比較復雜流程和工藝優化,相對技術門檻較高。

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