氨芐青黴素作用機制是幹擾受體菌細胞壁的合成。
氨芐青黴素通過抑制細菌細胞壁四肽側鏈和五肽交連橋的結合而阻礙細胞壁合成而發揮殺菌作用。氨芐青黴素的結構與細胞壁的成分粘肽結構中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可與後者競爭轉肽酶，阻礙粘肽的形成，造成細胞壁的缺損，使細菌失去細胞壁的滲透屏障，對細菌起到殺滅作用。
革蘭陽性菌對氨芐青黴素敏感，而革蘭陰性菌由於缺乏五肽交連橋，青黴素對其作用不大。所以其受體菌為革蘭氏陽性菌。