壹般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。具體操作方法如下：1）塗片固定。2）草酸銨結晶紫染色1分鐘。3）自來水沖洗。4）加入碘液覆蓋塗片表面，染色約1分鐘。6）加入幾滴 95% 的酒精，輕輕搖晃脫色，20 秒後用清水沖洗，並用吸水紙除去水分。7）番茄紅色染色液（稀釋）染色 1 分鐘，然後用自來水沖洗。烘幹，顯微鏡檢查。具體檢驗步驟 1、取載玻片用紗布擦幹，在載玻片的壹側用記號筆畫壹個小圓圈（用於確定菌滴的大致位置）。塗菌的地方要放在火上烤，去掉油脂。2、塗片：液體培養基：左手持裝有菌液的試管，在酒精燈火焰附近 5cm 左右打開瓶蓋；右手持接種環在火焰上燒灼，等冷卻後從試管中點滴菌液壹圈，在幹凈、無油脂的載玻片上塗上直徑約 2mm 的塗層，最後將接種環在火焰上燒灼滅菌。固體培養基：先在載玻片上滴壹滴無菌水，然後用接種環取少量菌液，塗布在載玻片上，使其稀薄均勻。3.幹燥：讓塗片在空氣中自然幹燥。4、固定：讓菌膜朝上，用火焰固定 2-3 次（最好不要燙到手）。5.染色：將固定好的塗片放在報紙上，加入草酸銨結晶紫溶液，染色 1 分鐘。6.漂洗：用水緩慢沖洗塗片上的染色液，用吸水紙吸幹。最後可觀察到細胞形態的簡單染色。7、媒染：加 1 滴碘液，染色 1min，清水洗凈。8、脫色：吸去殘水，繼續加 95%乙醇脫色 20-30 秒，至出液無紫色，立即用清水洗凈。9、復染：加入番茄紅復染 3-5 分鐘，用清水洗凈。至此，革蘭氏染色結束。結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。其重要的臨床意義在於1.鑒別細菌 2.選擇藥物 3.與致病性有關：革蘭氏陽性菌可產生外毒素，革蘭氏陰性菌可產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌細胞壁成分中的脂多糖，兩者具有不同的致病性。
革蘭氏染色時，初染前能否加入碘液？乙醇脫色後重新染色前，革蘭氏陽性菌
不能。因為染色時可使用革蘭氏碘液（媒染劑），不能加碘。這是因為克氏碘溶液（媒染劑）的作用是增加水晶紫染料與細胞之間的親和力或粘附力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使其不易脫落。改變順序可能會影響結果，因此最好壹步壹步來。脫色後重新染色前，理論上革蘭氏陽性菌呈紫色，陰性菌呈無色。復染的目的是增加無色陰性細菌與背景的對比度，以便將它們與紫色陽性細菌區分開來。革蘭氏陽性細菌的細胞壁很厚，肽聚糖網狀分子形成了壹種滲透屏障。當乙醇脫色時，肽聚糖脫水，屏障變窄，從而使晶體紫-碘復合物保留在細胞膜中。紫色。革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，交聯松散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂質含量較高，乙醇會溶於脂質中，間隙增大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，染紅後呈紅色。革蘭氏染色步驟：1.塗片，火焰固定 2.結晶紫 1min，使細菌呈紫色 3.水洗 4.碘溶液 1min，碘與結晶紫形成脂溶性大分子絡合物，分子較大，可被細胞壁阻擋留在細胞內 5.水洗 6.酒精脫色 30s，細胞壁組成和結構不同，出現的反應也不同。7.水洗 8.三七紅復染 1min，增加脫色菌與背景的對比度，並與未脫色菌區分。9.用吸水紙吸幹，油鏡觀察。
革蘭氏染色原理
革蘭氏染色原理：簡單地說：用結晶紫和碘媒進行初步染色後，在細菌細胞壁內形成不溶於水的結晶紫碘絡合物，然後用 95% 的乙醇脫色。
具體來說通過水晶紫初染劑和碘媒，在細胞壁內形成不溶性的水晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚，肽聚糖網絡層次和交聯較致密、因此在乙醇脫色的情況下，由於失去了水分，但網眼變窄，加之不含脂質，經乙醇處理後不會出現空隙，因而能將結晶紫和碘絡合物牢牢地留在細胞壁內。而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄，外膜層中脂質含量高，肽聚糖層薄且交聯性差，在脫色劑作用下，以脂質為主的外膜迅速被溶解，薄而疏松的肽聚糖網不能阻擋結晶紫和碘絡合物的溶解，乙醇脫色後仍為無色，再用紅色染料等經沙粒染色，使革蘭氏陰性菌G "菌：細胞壁很厚。G "細菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成滲透屏障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而使孔隙變窄，所以能在細胞膜上截留結晶紫-碘絡合物。
紫色。Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯松散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂質含量高，乙醇將脂質溶解，空隙增大，結晶紫-碘絡合物溶出細胞壁外，經紅色染料重染溶液後呈紅色。
擴展資料：
革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的壹種重要的鑒別染色法，屬於絡合染色法。這種染色法由丹麥醫生革蘭氏於 1884 年發明，最初用於從肺炎克雷伯菌中鑒別肺炎球菌。革蘭氏染色法壹般包括四個步驟：初染、媒染、脫色和再染。未經染色的細菌在顯微鏡下極難分辨，因為它們與周圍環境的折射率相差很小。
染色後，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列和壹些結構特征，可用於分類和鑒定。操作過程：革蘭氏染色法壹般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。具體操作方法為：（1）玻片固定。
在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌均勻塗布在潔凈的載玻片上，在火焰上加熱殺死菌株，使其粘附固定。(2) 草酸銨結晶紫染色 1 分鐘。
（3）用自來水沖洗，除去浮色。 （4）用碘化鉀溶液媒染 1 分鐘，倒去多余溶液。
(5) 用乙醇（95%）或丙酮酸等中性脫色劑脫色 30 秒，革蘭氏陽性菌不褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌褪色而無色。酒精脫色是整個過程中最關鍵的壹步。
（6）用紅色染料或沙黃再染色 30 秒，革蘭氏陽性菌仍為紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。可區分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。
參考鏈接：百度百科--革蘭氏染色。
革蘭氏染色的詳細步驟
革蘭氏染色
壹、目的：在細胞分裝前，用標準革蘭氏染色法檢測待分裝的細胞懸液，以確定細胞懸液中是否含有革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。
二、原理：
通過結晶紫初染和碘媒染色，在細胞壁上形成不溶性的結晶紫和碘絡合物，革蘭氏陽性菌由於細胞壁較厚，肽聚糖網絡層次多而交聯致密、所以在用乙醇脫色處理的情況下，由於失水反而使網孔變窄，加之其缺乏脂質，所以乙醇處理後不會出現空隙，因而能將結晶紫和碘絡合物牢牢地留在壁上，使其仍呈紫色；革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄，外膜層中脂質含量高，肽聚糖層薄且交聯性差，在脫色劑作用下，以脂質為主的外膜被迅速溶解、而薄而疏松的肽聚糖網不能阻擋結晶紫和碘絡合物的溶解，乙醇脫色後仍為無色，再用紅色染料等經沙黃色染色，所以革蘭氏陰性菌為紅色。
三、實驗用品的準備：
滅菌載玻片、10-100ul 移液管、10-100ul 滅菌移液管頭、100ul-1000ul 移液管、100ul-1000ul 移液管頭、接種環、酒精燈、打火機、革蘭氏染色液、吸墨紙、顯微鏡、雪松油、顯微鏡紙、計時器
。四、操作：
1塗片：取滅活的載玻片放在實驗臺上，用移液槍吸取10ul待檢樣品滴在載玻片中央，用帶紅顏色的冷卻接種環將塗片液滴成均勻的薄層，塗片面不宜過大。
2烘幹：將試樣正面朝上，握住載玻片兩端，小心地在酒精燈上高處稍加加熱，使水分蒸發，但不要靠近火焰或加熱時間過長，以防試樣烤枯變形。
3 固定：固定時常用高溫，手持載玻片壹端，標本向上，在酒精燈火焰處盡快來回通過2-3次，***約2-3秒，並不時將載玻片背面加熱至接觸皮膚，以不感到過熱為宜（不超過60℃），放置待冷後染色。
4 初染：在塗片上滴加草酸銨結晶紫 1-2 滴，使染色液覆蓋塗片，染色約 1 min。
5 水洗：將玻片斜放，在水龍頭下用小水流沖洗，至水洗下無色為止。
6 媒染：用 100-1000ul 移液槍吸取約 300ul 碘液滴在塗片上，使染色液覆蓋塗片，染色約 1min。
7 水洗：將玻片斜放，用水龍頭下的小水流沖洗，至洗下的水無色為止。
8 脫色：將玻片斜放，滴加 95%乙醇脫色，至乙醇流出不呈紫色為止，約需 20-30 秒，然後水洗。
9 復色：將玻片斜放，滴加 95%乙醇脫色，至乙醇流出不呈紫色為止，約需 20-30 秒，然後水洗。
9 復染：在塗片上滴 1-2 滴加沙黃染料，使染色液覆蓋塗片，染色約 1min。
10 水洗：將玻片斜放，在水龍頭下用小水流沖洗，直至洗下的水無色為止。
11 幹燥、觀察：用吸水紙吸去水珠，待標本幹燥後置於顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目標後在載玻片上滴壹滴浸油，在油鏡下觀察細菌的形態和顏色、紫色為革蘭氏陽性菌，紅色為革蘭氏陰性菌
要得到正確的革蘭氏染色結果註意哪些操作，哪壹步是關鍵步驟
革蘭氏染色結果，哪壹步是關鍵步驟
革蘭氏染色結果，哪壹步是關鍵步驟
革蘭氏染色：(1）塗片：塗片方法與簡單染色塗片相同。(2) 幹燥：與簡單染色法相同。(3) 固定：與簡單染色法相同。(4）結晶紫染色：將玻片置於廢液槽的玻片架上，加入適量結晶紫染色液（以覆蓋細菌包被面為度），染色 1 分鐘。 5）洗滌：倒去染色液，用清水仔細沖洗。(6) 媒染：滴加 Lugol's 碘液，媒染 1 分鐘。 (7) 漂洗：用清水洗去碘溶液。(8）脫色：傾斜玻片，連續加入 95%乙醇 20-25 秒，直至流出液為無色，然後立即用水沖洗。(9) 再染色：滴加番茄紅素再染色 5 分鐘。 (10) 水洗：用清水洗去塗片上的番茄紅素染色液。(11) 幹燥：將染色後的塗片置於空氣中晾幹或用吸水紙吸幹。(12）顯微鏡檢查：先用低倍鏡，再用高倍鏡，最後用油鏡觀察和判斷生物體的革蘭氏染色反應性。(13）實驗完成後：①將浸泡在油鏡中的鏡片按下列方法擦拭幹凈，a.首先用鏡面紙擦拭鏡片上的油汙。b.用鏡面紙蘸少許二甲苯將鏡片擦拭 2-3 次。c.再用幹凈的鏡面紙將鏡片擦拭 2-3 次。註意，單向擦拭鏡頭時。用廢紙將染色玻片上的杉木油擦幹凈。1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如果脫色過度，革蘭氏陽性菌也會被脫色而染上陰性菌；如果脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被革蘭氏陽性菌染上。脫色時間的長短還受塗片厚度和乙醇用量等因素的影響，很難嚴格界定。 2.染色過程中不要讓染色液變幹。用清水沖洗後，應將玻片上的殘留水吸掉，以免稀釋染色液，影響染色效果。3.選擇年輕的細菌。G+菌培養 12h-16h，大腸桿菌培養 24h，如果菌齡過長，由於菌體死亡或自溶常使革蘭陽性菌發生陰性反應。